Evaluation of Parallel Reaction Monitoring assays at discovery scale on a new hybrid nominal mass instrument for phosphoproteomics studies

Význam tématu

Studium fosfoproteomiky je zásadní pro pochopení buněčných signálních drah, protože fosforylace proteinů reguluje klíčové procesy včetně růstu, dělení a apoptózy. Vzhledem k heterogenitě a nízké zastoupení fosfoproteinů v komplexních biologických vzorcích je potřeba vysoce citlivých a selektivních metod pro jejich kvantitativní analýzu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vytvořit a ověřit přístupy založené na Parallel Reaction Monitoring (PRM) v měřítku discovery pro kvantifikaci fosfopeptidů. Studie porovnávala klasickou PRM (tMS2) s novou metodou tMS3 na hybridním hmotnostním spektrometru stellar nominal mass.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda zahrnovala následující kroky:

• Příprava vzorků: syntetické stabilně izotopové značené (SIL) fosfopeptidy byly dávkovány do tráveného digestu buněčných linií (HeLa a mix pěti nádorových buněčných linií) v rozsahu 0,018–40 fmol na kolonu.
• Obohacení: IMAC (immobilizovaná metal-iontová afinity) pro izolaci fosfopeptidů z matrice.
• Chromatografie: NanoUHPLC Thermo Scientific Vanquish Neo s kolonkou PepMap Neo 75 µm × 150 mm, gradient 30 minut.
• Hmotnostní spektrometrie: Stellar mass spectrometer s měřením tMS2 (HCD) a tMS3 (SPS-HCD nebo CID) pro zvýšení selektivity.
• Nástroj PRM Conductor: plugin pro Skyline-Daily sloužící k automatickému plánování a optimalizaci přechodů, definici šířky piku, S/N poměru a výběru nejlepších fragmentů.

Hlavní výsledky a diskuse

Obě metody (tMS2 a tMS3) dosáhly vynikající linearity a reprodukovatelnosti v rozsahu od atto- po femtomolární množství na kolonu. Metoda tMS3 prokázala lepší selektivitu a snížila mezní hranici kvantifikace pro vybrané fosfopeptidy. Reprodukce měření při několika vstupních úrovních (25–500 µg) ukázala detekci více než 190 endogenních fosfopeptidů v nejvyšších dávkách a přes 100 ve 25 µg vzorcích.

Přínosy a praktické využití metody

Vývoj PRM a tMS3 metod na novém hybridním přístroji nabízí:

• Vysokou citlivost v atto-molekulárním rozsahu.
• Zvýšenou selektivitu pomocí synchronní volby prekurzorů (SPS) v tMS3 režimu.
• Rychlou analýzu s gradientem 30 minut a vysokým počtem sledovaných peptidů (670).
• Možnost flexibilního přizpůsobení měřicího cyklu a rozšíření panelu cílových peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj nástrojů pro paralelní monitorování by mohl vést k ještě vyšší multiplexaci a automatizaci analýz fosfoproteomiky ve studiích velkého měřítka. Dalšími směry jsou:

• Integrace umělé inteligence pro optimalizaci přechodů a predikci fragmentací.
• Rozšíření tMS3 metodiky na další modifikace proteinů (ubikvitinace, acetylace).
• Miniaturizace a zkrácení doby analýzy pro klinické aplikace.

Závěr

Představené přístupy PRM a tMS3 na hybridním spektrometru demonstrovaly vysokou citlivost, selektivitu a robustnost pro kvantitativní fosfoproteomiku. Automatizace metody pomocí PRM Conductor výrazně usnadňuje tvorbu a optimalizaci metrologických protokolů pro studiích objevného a preklinického charakteru.

Reference

1. Keshishian et al., Molecular Systems Biology, 17(9), 2021
2. Abelin et al., Molecular & Cellular Proteomics, 15(5), 2016