Tips and tricks for LC–MS-based metabolomics and lipidomics analysis

Význam tématu

Metabolomika a lipidomika se zaměřují na komplexní analýzu nízkomolekulárních metabolitů a lipidů v biologických vzorcích. Tyto disciplíny umožňují odhalit molekulární mechanismy onemocnění, objevovat biomarkery a porozumět dynamice biologických procesů. Díky rozvoji LC–MS technologií a dostupnosti širokého spektra analytických a bioinformatických nástrojů je možné dosáhnout vysokého krytí metabolomu a lipidomu. Zároveň ale počet možných workflow a metod představuje pro začátečníky i zkušené odborníky výzvu při volbě optimálního postupu. Stejně tak je nutné řešit klíčové aspekty kvality dat včetně standardizace, kontroly kvality a reprodukovatelnosti výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři poskytují komplexní přehled nástrojů a postupů v oblasti LC–MS metabolomiky a lipidomiky a nabízejí praktického průvodce obsahující „tipy a triky“ pro optimalizaci celého workflow. Zahrnují doporučení pro:

• stanovení velikosti vzorku a plánování studie,
• sběr a přípravu vzorků,
• separaci a detekci metabolitů (převážně LC–MS),
• zpracování surových dat,
• kontrolu kvality,
• statistickou analýzu a
• sdílení dat.

Článkem provází přehled klíčových kompromisů a návod, jak předcházet nejčastějším úskalím a zajišťovat konzistentní a spolehlivá data.

Použitá metodika a instrumentace

Metody sběru vzorků:

• rychlé zastavení metabolismu (chladném dusík, mrazící svorky),
• uchovávání při –80 °C,
• rovnoměrné zpracování tkání, krevních sér a plasmatu s vhodným protisrážedlem.

Extrahování metabolitů:

• jednofázové extrakce (např. methanol, acetonitril, isopropanol),
• dvoufázové metody (MTBE/methanol/voda, chloroform/methanol/voda),
• třífázové extrakce pro oddělení neutrálních lipidů, glycerofosfolipidů a polárních metabolitů,
• SPE/SPME pro selektivní čištění.

Separace a detekce:

• UHPLC s RPLC (C18, C8, C30) a HILIC fázemi,
• možnosti NPLC a superkritická fluidní chromatografie (SFC) pro lipidy,
• elektrosprayová ionizace (ESI+/-),
• MS analyzátory: triple-quadrupol (QqQ), Q-TOF, orbitrap, Q/Orbitrap, ion mobility–MS (IM–MS),
• pro cílené analýzy režim MRM, pro neřízené DDA, DIA (SWATH, MSE).

Software a nástroje pro data processing: G*Power, MetSizeR, DSD (MATLAB/Octave) pro power analýzu; XCMS, MZmine, MS-DIAL, MetaboScape, Compound Discoverer pro detekci a alignaci; CSI:FingerID, CFM-ID, MS-Finder pro in-silico fragmentaci; knihovny METLIN, MoNA, NIST pro MS/MS identifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Autoři shrnují následující klíčové poznatky a doporučení:

1. Power analýza: pro pilotní neřízené studie min. 5–10 replik na skupinu, pro klinické studie 20–30, u buněk ≥5 × 10⁵ buněk, vyvažovat pohlaví.
2. Sběr vzorků: minimalizovat čas mezi odběrem a zmražením, volit vhodná protisrážedla, pečlivá kalibrace hmotnosti tkání.
3. Extrahování: dvoufázové metody (MTBE vs. chloroform) volit dle cílového krytí metabolomů vs. lipidomů; kontrolovat úroveň proteinové precipitace.
4. LC–MS: optimalizovat délku a průměr kolony, mobilní fáze a modifikátory (např. 10 mM amoniový formiát + 0,1 % kys. mravenčí pro RPLC lipidomiku; 10 mM amon. formiát + 0,125 % kys. mravenčí pro HILIC metabolomiku); věnovat pozornost kontaminantům (polydimethylsiloxany z víček, složení isopropanolu) a linearitě signálu v rámci detektoru.
5. MS/MS: pro lepší selektivitu volit úzké izolační okno (0,4–1 m/z), iterativní vylučování pro zvýšení pokrytí DDA, kontrolovat m/z toleranci 5 mDa, využívat CCS z IM–MS.
6. Data processing: optimalizovat parametry detekce šumu, dekonvoluce izomerů (např. leuciin/isoleucin, citrát/izocitrát, TG izomery), „trust but verify“ pomocí interních standardů, de-sorbitace, aduktová de-redundance.
7. Metabolitová anotace: využívat MS1 + MS/MS + RT (úroveň 1), in-silico fragmentaci a retenční čas, HDX-MS pro určení výměnných vodíků, kontrolovat iontové formy (H⁺, NH₄⁺, Na⁺, K⁺, HCOO⁻, Cl⁻).
8. Kvalita dat: pravidelné injekce poolovaných QC vzorků každých 10–20 vzorků, sledující blanky a řadu gradientních ředění QC pro odhalení kontaminace a nonlinearity; monitorovací grafy intenzity, RT a m/z chyb.
9. Normalizace: u plazmy/sera nepotřebná, u moče normalizovat na kreatinin/osmolalitu, buňky na DNA/protein, u tkání na hmotnost nebo protein; statistické metody LOESS, ComBat, SERRF pro odstranění nástrojových a šaržových efektů.
10. Statistická analýza: univariační testy (t-test, ANOVA + FDR), PLS-DA se skóre VIP >1 a validací Q² >0,5; MetaboAnalyst pro multivariační analýzy, obohacení a mapování drah.
11. Sdílení dat: konverze do open formátů mzML/mzXML, ukládání surových a zpracovaných souborů do repozitářů MetaboLights, Metabolomics Workbench, Zenodo; prosazování FAIR principů.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace navržených postupů vede k:

• snížení variability dat a vyšší reprodukovatelnosti,
• zvýšení počtu spolehlivě anotovaných metabolitů a lipidů,
• optimalizaci analytického výkonu (zkrácení doby měření, snížení spotřeby vzorku a chemikálií),
• zlepšení kvality biomarkerů a robustnosti klinických studií,
• efektivnějšímu sdílení a integraci dat napříč studiemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje:

• plné propojení neřízených a cílených analýz v reálném čase,
• rozšíření a sjednocení MS/MS knihoven (např. METLIN Gen2, NIST, MoNA),
• použití umělé inteligence a strojového učení pro automatickou anotaci a filtraci dat,
• zavádění ion mobility CCS databází pro vyšší selektivitu,
• tvorba atlasů metabolomů a lipidomů různých orgánů a stavů,
• standardizace postupů skrze mezinárodní konsorcia (mQACC, LSI),
• rozvoj automatizovaných a miniaturizovaných platforem pro high-throughput screening.

Závěr

Metabolomika a lipidomika založené na LC–MS se díky kontinuálním inovacím v přípravě vzorků, instrumentaci a bioinformatice dostávají do popředí molekulárního výzkumu i klinické praxe. Klíčem k úspěchu je komplexní přístup zahrnující pečlivé plánování studie, optimalizaci extrakčního a chromatografického protokolu, přísné kontroly kvality, propracované zpracování dat a robustní statistickou analýzu. Dodržování navržených „tipů a triků“ a zásad FAIR zajistí vznik spolehlivých, srovnatelných a biologicky významných výsledků, které budou přínosem pro personalizovanou medicínu, fyziologii, toxikologii či průmyslovou kvalitu kontroly.

Reference

• Rakusanova S., Cajka T. Tips and tricks for LC–MS-based metabolomics and lipidomics analysis. Trends in Analytical Chemistry 180 (2024) 117940.