Fast Top-Down Analysis via Orbitrap and Astral Analyzers

Význam tématu

Top-down hmotnostní spektrometrie intaktních proteinů umožňuje detailní charakterizaci proteoform, včetně posttranslačních modifikací a variant glykozylace. Rychlá a citlivá analýza těchto biomolekul má zásadní význam v biologickém výzkumu, farmaceutickém vývoji monoklonálních protilátek a v kontrolách kvality proteinových léčiv.

Cíle a přehled studie

Studie měla demonstrovat schopnost nového hybridního Orbitrap Astral spektrometru provádět rychlou Top-down analýzu intaktních proteinů. Autoři porovnávali výkon paralelně běžících analyzátorů Orbitrap a Astral při měření a fragmentaci standardních proteinů včetně myoglobinu, karboanhydrázy a monoklonálních protilátek Humira a NISTmAb.

Použitá metodika

Pro analýzu intaktních proteinů byl vyvinut speciální režim s optimalizovaným tlakem v iontovém procesoru a IRM. Proteiny byly infundovány nebo separovány v LC systému Vanquish Neo s kapilární kolonkou MAbPac. Pro datově řízenou akvizici (DDA) byl použit protokol Top10 s Orbitrap Full-MS a Astral MS/MS. K eliminaci kolizního rozptylu byly sníženy tlaky v kritických zónách spektrometru. Pro vyhodnocení fragmentace byla použita software ProSight Lite a Proteome Discoverer 3.1 s uzpůsobenými databázemi.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Orbitrap Astral mass spectrometer
• Vanquish Neo kapalinová chromatografie
• MAbPac Capillary Reversed Phase HPLC Column (0,15 × 150 mm)
• Dual-region Extraction Ion Trap (ion processor) a IRM
• ProSight Lite a Proteome Discoverer 3.1 (ProSightPD)

Hlavní výsledky a diskuse

Profilové spektra infundovaných proteinů ukázala, že Astral analyzátor generuje hustě osídlené spektra, která vyžadují vícečetné průměrování pro vytvoření shodné kvality s Orbitrapem. Fragmentační MS/MS analýzy karboanhydrázy (m/z 854,7) prokázaly 28 % řetězcových štěpení v Astral datech oproti 25 % u Orbitrapu. Hybridní Top10 DDA režim poskytl desítky vysoce kvalitních MS/MS spekter v rámci 22minutové analýzy standardní směsi šesti proteinů. U monoklonálních protilátek byly glykoformy v Astral spektru patrně rozlišené, avšak software zatím nedokáže plně zpracovat enormní množství datových bodů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje podstatně rychlejší top-down analýzu intaktních proteinů než konvenční Orbitrap-only přístup. Zvýšená akviziční frekvence Astral analyzátoru slibuje rychlé mapování proteoform, což je výhodné v biomedicínském výzkumu, při vývoji proteinových léčiv a v rutinní QA/QC praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vylepšení softwaru pro výběr signálních špiček (peak picking) a adaptivní řízení rychlosti sběru dat umožní plné využití vysoké citlivosti Astral analyzátoru. Integrace pokročilé dekonvoluce a umělé inteligence v data-processing pipeline povede k lepšímu rozlišení komplexních biologických vzorků a rozšíří uplatnění v klinické proteomice.

Závěr

Orbitrap Astral hybridní spektrometr prokázal schopnost rychlé a citlivé top-down analýzy intaktních proteinů. Přestože je nutné průměrování pro těžší proteiny a adaptace softwaru, metoda otevírá nové možnosti pro efektivní charakterizaci proteoform a zrychluje workflow v proteinové analýze.

Reference

• Stewart H. et al. Analytical Chemistry, 95(42), 15656–15664 (2023)
• Stewart H. et al. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 35(1), 74–81 (2023)
• Viner R. et al. Proceedings of the 65th ASMS Conference, Indianapolis (2017)