Protein quality control in SPR and BLI high-throughput screening studies

Význam tématu

Vysokopropustné metody povrchové plasmonové rezonance (SPR) a bio-vrstvové interferometrie (BLI) se široce využívají pro screenování terapeutických kandidátů. Klíčovým předpokladem přesných a reprodukovatelných měření je kvalita proteinových vzorků a roztoků, které se do přístrojů vkládají. Nezbytná je včasná identifikace agregátů, kontaminantů a samoasociace, aby se zabránilo chybným vazebným křivkám, poškození mikrofluidiky a ztrátě cenných dat.

Cíle a přehled studie

Autoři prezentují integraci vysokopropustné dynamické rozptylové spektroskopie (HT-DLS) pomocí přístroje DynaPro Plate Reader před vlastním SPR nebo BLI screenováním. Hlavním cílem je umožnit rychlou, neinvazivní a automatizovanou kontrolu kvality proteinových roztoků v průmyslových mikropolyškách (96, 384, 1536 well) bez ruční manipulace a minimalizovat riziko falešných nebo nekonzistentních dat.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda založená na dynamickém rozptylu světla zachycuje fluktuace intenzity rozptýleného laserového paprsku v důsledku Brownova pohybu částic. Software DYNAMICS provádí autocorelační analýzu a převádí difuzní koeficienty na hydrodynamické poloměry pomocí Stokes–Einsteinovy rovnice.
Seznam instrumentace:

• DynaPro Plate Reader (Wyatt Technology) pro HT-DLS v mikropolyškách
• Software DYNAMICS pro automatizované generování heat map a velikostních distribucí
• Systémy SPR a BLI pro následné vazebné assay (např. biotinylační pipetovací robotika, mikrofluidické čipy a optické sondy)
• Vestavěná kamera pro vizuální kontrolu každé jamky po měření

Hlavní výsledky a diskuse

Studie ukazuje, že:

• Agregáty a velké částice vyvolávají náhlé „špičky“ signálu a šum, zkreslují hodnocení afinity a kinetiky, případně mohou ucpat mikrofluidiku.
• Samoasociace proteinu vede ke změně aktivity monomeru v závislosti na koncentraci, což posouvá rovnovážnou vazebnou izotermu a vede k nesprávným odhadům Kd a rychlostí vazby/rozvazby.
• DynaPro Plate Reader pomocí heat map rozřadí jamky na vysokou, střední a nízkou kvalitu. Černé (nízká kvalita) a modré (střední kvalita) jamky lze na základě DLS výsledků eliminovat nebo opatrně vyhodnocovat.
• Kamera umožňuje snadno rozeznat vysrážení, bubliny nebo kontaminaci ve specifických jamkách.
• Senzitivita detekce je až 0,125 mg/mL pro lysozym (14,4 kDa) a proporcionálně lepší pro větší proteiny či agregáty.
• DLS určuje difuzní koeficient, který pomáhá vyčíslení hmotnostně omezené vazby (mass transfer) v SPR (km ∝ D2⁄3) a tloušťky difuzní vrstvy.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace HT-DLS před SPR/BLI screeningem přináší:

• Prevence ucpat mikrofluidické kanálky a usnadnění bezproblémového běhu skríningu
• Zvýšení spolehlivosti dat díky předběžnému odstranění nekvalitních vzorků
• Úsporu času a nákladů v procesu objevu nových léčivých kandidátů
• Možnost opětovného využití stejné mikropolyšky pro měření interakcí bez další manipulace
• Podpora následných formulací a hodnocení stabilních forem proteinu

Budoucí trendy a možnosti využití

V dalším rozvoji se očekává:

• Integrace DLS do plně automatizovaných robotic‐kých work‐flow kombinujících různé biofy‐zikální analýzy
• Pokročilé algoritmy strojového učení k rozpoznávání vzorců agregací a predikci stability
• Miniaturizace a zvýšení hustoty jamkových formátů pro ultra‐vysokopropustné screeningy
• Validace metody pro širší spektrum biologických částic (nanobody, liposomy, viry)

Závěr

Předběžná vysokopropustná kontrola kvality proteinových roztoků pomocí dynamického rozptylu výrazně zvyšuje spolehlivost a efektivitu SPR a BLI screeningů. Nasazení DynaPro Plate Readeru minimalizuje riziko chyb a ucpání zařízení, přispívá k úspoře času a finančních prostředků a zpřesňuje výběr terapeutických kandidátů.

Reference

• Karlsson R., Roos H., Fägerstam L., Persson B.: Kinetic and Concentration Analysis Using BIA Technology. Methods 6, 99–110 (1994).
• Saito S. et al.: Effects of ionic strength and sugars on the aggregation propensity of monoclonal antibodies: influence of colloidal and conformational stabilities. Pharm. Res. 30, 1263–1280 (2013).
• Razinkov I., Treuheit M.J., Becker G.W.: Methods of High Throughput Biophysical Characterization in Biopharmaceutical Development. Curr. Drug Discov. Technol. 10, 59–70 (2013).