The diffusion interaction parameter (kD) as an indicator of colloidal and thermal stability

Význam tématu

Stabilita terapeutických bílkovin je klíčová pro jejich úspěšné nasazení jako léků. V praktickém vývoji biologických molekul je nutné vyhodnotit jejich odolnost vůči agregaci, teplotním změnám a nespecifickým mezimolekulárním interakcím. Včasné a spolehlivé stanovení těchto parametrů šetří čas, náklady i vzorky a umožňuje rychlejší výběr optimálních formulací.

Cíle a přehled studie / článku

Tento white paper představuje způsob, jak pomocí vysokoprůchodového screeningu dynamickým a statickým rozptylem světla (HTS-DLS/SLS) současně vyhodnotit:

• kolloidní stabilitu skrze difuzní interakční parametr kD
• tepelnou stabilitu podle teploty nástupu agregace (Tonset)
• skutečný stav a distribuci agregátů

Studie ukazuje, jak se tyto parametry vzájemně ovlivňují a jak je lze rychle porovnat mezi různými pH, koncentracemi a formulacemi.

Použitá metodika a instrumentace

Proteinový vzorek (monoklonální protilátka mAb1) byl připraven v bufferu bis-tris-propane (BTP) při pH 6,5–9,5 v rozsahu koncentrací 0,47–15 mg/ml a nanesen do 384-jamkové mikrodestičky. Po ochraně proti odpařování parafinovým olejem byly vzorky měřeny na přístroji DynaPro Plate Reader III vybaveném funkcí HTS-DLS/SLS. Proběhl lineární nárůst teploty od 25 °C do 85 °C při 0,1 °C/min s průběžným zaznamenáváním difúzního koeficientu, hydrodynamického poloměru a výpočtem kD z koncentrace a Dt.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve všech testovaných pH vykazovala protilátka kD<0, tedy převažující atraktivní mezimolekulární síly. Při pH 8,5 nastupovala masivní agregace již kolem 55–56 °C, kdy se Rh rychle zvyšovalo na stovky nanometrů až mikrometry a Tonset klesala s rostoucí koncentrací. Naopak při pH 9,5 probíhala reverzibilní oligomerizace, agregáty měly menší velikost (do 300 nm) a stabilizovaly se po první přechodové fázi. Změna kD detekovala termálně indukované rozbalení proteinu o několik stupňů C ještě před detekcí agregace podle Rh, což potvrzuje citlivost parametru kD na odhalení skrytých hydrofobních či nabitých oblastí.

Přínosy a praktické využití metody

HTS-DLS nabízí:

• současné posouzení kolloidní a tepelné stability
• identifikaci nejvhodnějších formulací již v rané fázi vývoje
• úsporu vzorku, času a přístrojového vybavení
• možnost rozšíření na screening chemické stability, viskozity a dalších kritických parametrů

Metoda umožňuje rychle třídit stovky podmínek a usnadňuje rozhodování o progresi kandidátů do dlouhodobých studií.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace HTS-DLS se systémy řízené umělou inteligencí pro predikci stability, rozšíření na 1536-jamkové destičky a kombinace s dalšími separačními či detekčními technikami (SEC-MALS, spektroskopie). Dále lze kombinovat screening stability s měřením viskozity a chemické degradace pro komplexní charakterizaci vysokokoncentrovaných formulací.

Závěr

Strategie HTS-DLS/SLS umožňuje efektivní paralelní vyhodnocení klíčových parametrů stability bílkovin; difuzní interakční parametr kD se ukazuje jako citlivý indikátor počátku unfoldingu a zmíněné metody společně poskytují bohaté množství dat pro rychlé porovnání a optimalizaci biofarmaceutických formulací.

Reference

1. Jocks T., Roessner D. Performing Automated Dynamic Light Scattering Using Plate Reader Technology. Int. Pharm. Ind. 2009;2:22–25.
2. Some D., Hitchner E. Characterizing protein-protein interactions via static light scattering: Nonspecific interactions. 2016.
3. Kuehner D.E. et al. Interactions of lysozyme in concentrated electrolyte solutions from dynamic light-scattering measurements. Biophys. J. 1997;73:3211–3224.
4. Teraoka I. Polymer Solutions: An Introduction to Physical Properties. Wiley, 2002.
5. Roberts D. et al. The Role of Electrostatics in Protein–Protein Interactions of a Monoclonal Antibody. Mol. Pharm. 2014;11:2475–2489.
6. He F. et al. High-throughput assessment of thermal and colloidal stability parameters for monoclonal antibody formulations. J. Pharm. Sci. 2011;100:5126–5141.
7. Lehermayr C., Mahler H.-C., Mäder K., Fischer S. Assessment of net charge and protein-protein interactions of different monoclonal antibodies. J. Pharm. Sci. 2011;100:2551–2562.
8. Saito S. et al. Effects of ionic strength and sugars on the aggregation propensity of monoclonal antibodies: influence of colloidal and conformational stabilities. Pharm. Res. 2013;30:1263–1280.
9. Menzen T., Friess W. Temperature-Ramped Studies on the Aggregation, Unfolding, and Interaction of a Therapeutic Monoclonal Antibody. J. Pharm. Sci. 2014;103:445–455.
10. Zidar M., Šušterič A., Ravnik M., Kuzman D. High Throughput Prediction Approach for Monoclonal Antibody Aggregation at High Concentration. Pharm. Res. 2017;34:1831–1839.
11. Esfandiary R. et al. Mechanism of reversible self-association of a monoclonal antibody: role of electrostatic and hydrophobic interactions. J. Pharm. Sci. 2015;104:577–586.
12. He F. et al. High-throughput dynamic light scattering method for measuring viscosity of concentrated protein solutions. Anal. Biochem. 2010;399:141–143.