Multifaceted Evaluation of IgG Glycan Profiles Considering the Components in Glycosyltransferase Reactions

Význam tématu

Správné řízení profilu N-vázaných glykosidů protilátek je klíčové pro kvalitu, účinnost a bezpečnost biofarmaceutik. Galaktosylace ovlivňuje komplementem dependentní cytotoxicitu (CDC), zatímco defukosylace zvyšuje aktivitu ADCC. Multifaktoriální analýza komponent glykozyltransferázových reakcí umožňuje cílené optimalizace kultivačních podmínek a stabilní produkci protilátek s požadovanými glykany.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo komplexně vyhodnotit vliv substrátů, kofaktorů a intermediátů glykozyltransferázové reakce na galaktosylaci protilátek IgG. Modelovou soustavou byly CHO-K1 buňky produkující IgG, kultivované v dávkovaných podmínkách bez přídavků (kontrola), s přídavkem Mn a ve variantě s Mn a galaktózou.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky kultivačního média a buněčných pelet byly pravidelně odebírány a zpracovány:

• Analýza kovových iontů (Mn) v supernatantu: ICPMS-2050 (Application News 01-00712), 1 % HNO₃/0,5 % HCl, 20× ředění.
• Analýza volných cukrů v supernatantu: LCMS-8060NX, precipitace acetonitrilem, 10× ředění, MRM režim.
• Analýza intracelulárních cukrů a sugar‐nukleotidů: LCMS-8060NX, extrakce methanolem, centrifugace, sušení, znovurozpuštění v H₂O.
• Profilování glykanů z protilátek: purifikace, uvolnění a značení glykanů 2-AB (EZGlyco mAb-N Kit), HPLC-RF na Nexera XR, Shim-pack GIST-HP Amide kolona.
• Hodnocení životaschopnosti a koncentrace buněk (VCC): Vi-CELL BLU s trypanovou modří.

Hlavní výsledky a diskuse

• Životaschopnost i VCC nebyly ovlivněny přídavkem Mn ani galaktózy, kultivace byla netoxická.
• Při doplnění Mn došlo ke zvýšenému vstřebávání Mn buňkami, přidání galaktózy mělo podobný efekt.
• Galaktóza byla spotřebována a převáděna na UDP-galaktózu v buňkách, což potvrzuje funkčnost glykozyltransferázové dráhy.
• Poměr galaktosylovaných glykanů (G1F, G2F) se zvyšoval v pořadí kontrola < +Mn < +Mn/+Gal a při +Mn/+Gal zůstal vyšší i ve stacionární fázi.

Přínosy a praktické využití metody

Multikomponentní přístup umožňuje porozumět mechanistickým příčinám změn profilu glykanů, což je nezbytné pro cílenou optimalizaci bioreaktorových podmínek. Metoda podporuje vývoj stabilních procesů pro produkci protilátek s požadovanou účinností CDC/ADCC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření o další metabolické komponenty (např. fosfáty, aminokyseliny) může prohloubit porozumění regulaci glykanogeneze. Integrace dat s metabolomikou a proteomikou otevře cestu k systémové optimalizaci produkčních buněk.

Závěr

Prokázali jsme, že kombinovaná analýza substrátů, kofaktorů a sugar‐nukleotidů poskytuje komplexní pohled na glykozyltransferázové reakce a usnadňuje vývoj kultivačních podmínek pro řízenou galaktosylaci protilátek. Tento přístup podporuje výrobu biofarmaceutik s konzistentním a požadovaným glykánovým profilem.

Reference

1. Wang Z., Zhu J., Lu H. Antibody Glycosylation: Impact on Antibody Drug Characteristics and Quality Control. Applied Microbiology and Biotechnology. 2020;104(5):1905–1914.
2. Shimadzu Corporation. Analysis of Metal Elements in Culture Medium Using ICPMS-2050. Application News 01-00712.