METABOLOMIC PROFILING OF OSTEOBLAST EXTRACELLULAR VESICLES AND MATRIX BOUND VESICLES USING A PROTOTYPE BENCHTOP MULTI REFLECTING TIME-OF-FLIGHT (MRT) MASS SPECTROMETER

Význam tématu

Extracelulární vezikuly (EV) a matrix-bound vezikuly (MBV) představují klíčové mediátory v mezibuněčné signalizaci a mineralizaci kostní tkáně. Rozlišení jejich metabolického profilu umožňuje lepší pochopení mechanismů formování a remodelace kosti, což má dopad na výzkum osteogeneze, regenerativní medicínu a diagnostiku kostních poruch.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie se zaměřila na komparativní metabolomické profilování EV a MBV izolovaných z osteogenně diferencovaných MC3T3 pre-osteoblastů. Cílem bylo využít nově komercializovaný benchtop hmotnostní spektrometr Xevo MRT MS ve spojení s ACQUITY Premier LC k odhalení rozdílů v metabolitech obou typů vezikul.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byly EV izolovány z kultivačního media ultracentrifugací a lyzovány sonikací bez denaturačního pufru. MBV byly uvolněny z extracelulární matrice kolagenázovou digescí a následně izolovány ultracentrifugací. Extrakty prošly extrakcí vodou:MEOH:MTBE a vodná fáze byla analyzována LC-MS. Chromatografie zahrnovala HILIC na kolonce BEH Amide (flow 0,25 ml/min, 50 °C) a reverzní fázi HSS T3 (flow 0,4 ml/min). Data byla pořízena metodou data independent analysis (50–1200 Da, 10 Hz) v pozitivním i negativním módu a zpracována v softwaru waters_connect a MARS (MassAnalytica).

Hlavní výsledky a diskuse

PCA a volcano analýzy odhalily výrazné odlišení metabolických profilů EV a MBV. V EV byly vyšší hladiny glycerofosfolipidů (např. 1-palmitoylphosphatidylcholin ~5×), glykolipidů a mastných acylů, zatímco v MBV dominovaly specifické mastné acylglykozidy (např. 3-β-galactopyranosyl glukóza ~50×). Rozdíly naznačují odlišnou funkční roli ve strukturální stabilizaci membrán a mineralizačních procesech.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoké rozlišení (až 100 000 FWHM) a sub-ppm přesnost MRT TOF MS zvyšují počet detekovaných sloučenin.
• Minimalizace falešných pozitiv v databázových identifikacích pro OMIC aplikace.
• Rychlá a robustní analýza benchtop přístrojem vhodná pro rutinní a výzkumné laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace vysoce rozlišovacích přístupů s prostorově rozlišenými technikami (imaging MS) může rozšířit pochopení distribuce EV/MBV v tkáni. Dále lze očekávat kombinaci s proteomickými a genomickými daty pro komplexní multi-OMIC profily. Využití ve vývoji biomateriálů a diagnostice kostních metabolitů slibuje nový přístup k biomarkerům a léčebným strategiím.

Závěr

Feasibility studie prokázala, že kombinace ACQUITY Premier LC a Xevo MRT MS poskytuje citlivou, přesnou a vysoce rozlišovací platformu pro rozlišení metabolitů EV a MBV. Zjištěné rozdíly podtrhují specifickou roli obou typů vezikul v kostní mineralizaci a otevírají cestu pro další aplikace v analytické chemii a biomedicíně.

Použitá instrumentace

• Xevo MRT Mass Spectrometer (Waters Corporation)
• ACQUITY Premier LC System (Waters Corporation)
• Kolonky BEH Amide a HSS T3 (Waters Corporation)
• Softwarové platformy waters_connect a MARS (MassAnalytica)

Reference

1. Al Halawani A et al. Extracellular Vesicles: Interplay with the Extracellular Matrix and Modulated Cell Responses. Int J Mol Sci. 2022;23(6):3389.
2. Boyan BD et al. The Role of Matrix-Bound Extracellular Vesicles in the Regulation of Endochondral Bone Formation. Cells. 2022;11(10):1619.
3. Davies OG. Extracellular vesicles: From bone development to regenerative orthopedics. Mol Ther. 2023;31(5):1251–1274.
4. Mebarek S et al. Media Extracellular Vesicles and Extracellular Vesicles Bound to the Extracellular Matrix Represent Distinct Types of Vesicles? Biomolecules. 2024;14(1):42.