Quantification of Oligonucleotide Therapeutics in Plasma Using a Generic Kit-Based Approach

Význam tématu

Bioanalýza oligonukleotidů je klíčová pro vývoj a monitorování terapeutik založených na antisense, siRNA a dalších modulátorech genové exprese. Efektivní a robustní extrakce z plazmatických vzorků je často náročná na vývoj, čas i kvalifikaci personálu. Univerzální, kitově založený přístup s automatizací může významně zrychlit a zjednodušit celou workflow, zvýšit reprodukovatelnost a usnadnit implementaci v rutinním provozu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit prototypový AX-SPE Microplate Kit pro automatizovanou extrakci oligonukleotidů z plazmy, dosáhnout vysoké účinnosti recovery, nízkých maticových efektů a reprodukovatelnosti mezi operátory a dny. Výzkum zahrnoval různé typy oligonukleotidů včetně fosforothioátových antisense, GalNAc a lipid konjugovaných molekul.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky plazmy preparovány prototypovým AX-SPE Microplate Kitem s automatizací na Andrew+ Pipetting Robotu
• Digesce vzorků 1 hodinu při 55 °C
• Chromatografická separace na ACQUITY I-Class PLUS UPLC se sloupcem PREMIER Oligonucleotide BEH C18 (1.7 µm, 2.1x50 mm)
• Detekce LC-MS/MS na Waters Xevo TQ-XS (negativní ESI), gradient HFIP/DIPEA v H₂O a ACN, průtok 0.6 mL/min, doba analýzy 5 minut
• Rozsah injekčního objemu: 1–30 µL

Hlavní výsledky a diskuse

Recovery oligonukleotidů z plazmy dosahovala nad 75 % pro všechny testované sekvence včetně 15–35mer dT mix, antisense modulátorů GEM91/GEM132, GalNAc siRNA a lipid konjugovaných oligonukleotidů. Maticové efekty zůstaly v tolerovaných mezích (do ±15 %) a mezioperační i mezi-denní RSD byly rovněž pod 15 %. Automatická extrakce vykázala srovnatelnou výkonnost s manuální přípravou a zachovala linearitu signálu při proměnných počátečních objemech vzorku (12.5–300 µL) a injektovaných objemech (1–30 µL).

Přínosy a praktické využití metody

• Minimalizace doby a práce nutné pro vývoj metody díky universálnímu kitu
• Automatizace zvyšuje reprodukovatelnost a snižuje chyby mezi uživateli
• Vysoká citlivost a robustnost vhodná pro biofarmaceutický výzkum i QC nasazení
• Flexibilita pro různé typy oligonukleotidů a konjugátů

Budoucí trendy a možnosti využití

S rozšířením oligonukleotidové terapie roste poptávka po rychlých a spolehlivých bioanalytických pracovních postupech. Dalšími kroky mohou být validace kitu pro další biologické matrice, integrace s on-line systémy pro real-time monitoring a rozšíření o multiplexní analýzu vícesložkových vzorků.

Závěr

Prototypový AX-SPE Microplate Kit v kombinaci s Andrew+ Pipetting Robotem umožňuje standardizovanou, rychlou a vysoce reprodukovatelnou extrakci oligonukleotidových terapeutik z plazmy. Metoda poskytuje vysoké recovery, nízké maticové efekty a konzistentní přesnost pro širokou škálu oligonukleotidů.

Reference

• Waters Technology Library Literature Codes: 720008066EN, 720008067EN, 720008068EN