Introducing a Rapid Throughput LC-MS Method for Cell Culture Media Nutrient and Metabolite Analysis Supporting Upstream Bioprocessing

Význam tématu

Správné složení a koncentrace živin a metabolitů v kultivačním médiu je zásadní pro optimální růst buněk, kvalitu biopreparátu a výtěžek v bioprocesním výzkumu. Rychlé a spolehlivé metody pro jejich monitorování umožňují bioprocesním inženýrům činit rozhodnutí v reálném čase a zkracovat dobu vývoje bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje zkrácenou devítiminutovou metodu LC-MS pro přímou analýzu více než 220 živin a metabolitů v médiích pro buněčnou kultivaci. Cílem je snížit dobu analýzy o 50 % oproti původnímu dvacetiminutovému protokolu, aniž by došlo ke ztrátě kvality dat, pokrytí sloučenin či reprodukovatelnosti výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky kultivačního média (komerční i vypotřebované) byly po odstopkování a filtraci ředěny v poměru 1:100 až 1:400 0,1% kyselinou mravenčí s přídavkem stabilně značeného tyrosinu jako interního standardu. Automatizované pipetování zajistil robot Andrew+ Pipetting Robot. Chromatografická separace proběhla na kolonu ACQUITY Premier HSS T3 (2,1×100 mm) za použití reverzní fáze. Detekce byla realizována na BioAccord LC-MS systému ve dvojím režimu ionizace (ESI+ pro aminokyseliny, ESI– pro glukózu a vybrané metabolity). Pro vyhodnocení sloužila platforma waters_connect s možností MVDA v EZInfo.

Hlavní výsledky a diskuse

Devítiminutová metoda zachovala analytické pokrytí 220+ sloučenin se srovnatelnou účinností, přesností (RSD < 10 %) a lineárním rozsahem jako původní 20minutový protokol. Extrahované iontové chromatogramy ukázaly ostré a symetrické píky včetně bazální separace izobarních párů isoleucin/leucin a 2-aminobutyrát/4-aminobutyrát. Trendy koncentrací aminokyselin (asparagová kyselina, leucin, fenylalanin) a glukózy ve vzorcích z CHO kultivací vykazovaly výbornou korelaci mezi devítiminutovým a 20minutovým měřením i s externím analyzátorem Nova Flex2.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlost: devítiminutová doba běhu umožňuje vysoký průtok vzorků.
• Široké pokrytí: monitorování živin a metabolitů nad 220 sloučeninami.
• Jednoduchost přípravy: pouze ředění vzorku, bez derivatizace.
• Automatizace: snadná implementace v režimu walk-up s robotickým pipetováním.
• Komplexní workflow: od přípravy až po MVDA analýzu v jednom prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření knihoven o nové metabolity a integrace umělé inteligence pro automatickou identifikaci neznámých sloučenin. V rámci průmyslové výroby by metoda mohla sloužit k online monitoringu kultivačních procesů a prediktivní optimalizaci živné strategie v reálném čase.

Závěr

Devítiminutová LC-MS metoda pro analýzu kultivačních médií kombinuje rychlost a vysokou datovou kvalitu bez kompromisů v pokrytí sloučenin. Díky jednoduché přípravě vzorků a plně automatizovatelnému workflow představuje efektivní nástroj pro podporu rozvoje bioprocesů.

Reference

1. YW Alelyunas, MD Wrona, W Chen, Monitoring Nutrients and Metabolites in Spent Cell Culture Media for Bioprocess Development Using the BioAccord LC-MS System with ACQUITY Premier, Waters Application note 720007359, 2021.
2. YW Alelyunas, MD Wrona, YQ Yu, Quantification of Underivatized Amino Acids in Cell Culture Media Using the BioAccord LC-MS System, Waters Application note 720007766, 2022.
3. YW Alelyunas et al., Monitoring Intact Glycoprofiles and Spent Media Metabolites in Samples from Sartorius Ambr 250 High Throughput Bioreactor System, Waters Application note 720008042, 2023.
4. YW Alelyunas et al., Simplifying Bioreactor In-Process Monitoring with Waters Bioprocess Walk-Up Solutions, Waters Application note 720008062, 2023.