Monitoring Intact Glycoprofiles and Spent Media Metabolites in Samples from Sartorius Ambr 250 High Throughput Bioreactor System to Support Upstream Process Development

Význam tématu

Produkce a kvalita monoklonálních protilátek jsou ovlivněny glykozylací a stavu živin v kultivačním médiu.
Rychlá a simultánní analýza intact mAb a mediálních metabolitů umožňuje lepší řízení kritických parametrů procesu.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie demonstruje automatizaci přípravy vzorku a použití LC-MS BioAccord pro přímou analýzu intact mAb a živin/metabolitů ve vyčerpaném kultivačním médiu.
Vzorky pocházely ze systému Ambr® 250, kde se optimalizovalo médium, přísun živin a hustota inokula ve vícerých bioreaktorech.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky kultivačního média byly odstředěny, filtrované a automaticky ředěné robotem Andrew+ s workflow OneLab.
Intact protilátky se analyzovaly reversed-phase LC-MS na BioAccord systému s mobilní fází B 90 % ACN/10 % IPA.
Metabolity a živiny se kvantifikovaly v rozsahu m/z 50–800 za použití stejného LC-MS nastavení.
Protein A purifikace probíhala na modulu Andrew Extraction+ s eluční zónou 100 mM glycin.

Hlavní výsledky a diskuse

• Přímá analýza média identifikovala pět hlavních glykoform: G0F, G1F, G2F a jejich izomery.
• Glykoformy z clarifikovaného média a po Protein A purifikaci byly srovnatelné, což umožňuje zjednodušení vzorkopřípravy.
• Korelace LC-MS UV a MS signálu s IgG titrem z Cedex Bio HT dosáhla R2 = 0,90 resp. 0,95, potvrzující spolehlivou kvantifikaci intact mAb.
• V screeningové metodě bylo detekováno >100 sloučenin (aminokyseliny, cukry, lipidy, organické kyseliny) a sledovány jejich časové trendy (např. spotřeba tryptofanu, akumulace cholinu).

Přínosy a praktické využití metody

• Sjednocení glykoprofilingu a analýzy mediálních metabolitů na jednom LC-MS systému.
• Automatizace přípravy vzorků zrychluje workflow a minimalizuje operátorské chyby.
• Rychlé a komplexní informace podporují rozhodování o kritických parametrech procesu (CPP) v reálném čase.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu CQA o další modifikace proteinu či kontaminanty prostřednictvím doplňkových modulů LC-MS.
• Integrace strojového učení pro predikci optimálních kultivačních podmínek na základě glykoprofilů a metabolitových dat.
• Implementace online/off-line loopu pro reálné časové řízení bioprocesu a automatizovanou optimalizaci.

Závěr

Automatizované workflow s BioAccord LC-MS a robotem Andrew+ umožňuje rychlé a spolehlivé měření intact mAb glykoform, titru a mediálních metabolitů ze vzorků z Ambr 250.
Tato metoda výrazně zkracuje dobu analýzy, snižuje náklady na přípravu vzorků a podporuje efektivní optimalizaci upstream procesů.

Reference

1. Shion H. et al. Intact Mass™ – waters_connect™ Application for Rapid Mass Confirmation. Waters Application Note 720007547, 2022.
2. Alelyunas YW. et al. Monitoring Nutrients and Metabolites in Spent Media. Waters Application Note 720007359, 2021.
3. Koza SM. et al. Automated High-Throughput mAb Purification Using Protein A Resin. Waters Application Note 720007861, 2023.
4. Alelyunas YW. et al. High Sensitivity Intact mAb HRMS Quantification. Waters Application Note 720006222, 2018.