ATE: Integrated characterization of a lysine-linked antibody-drug conjugate by native intact mass analysis and peptide mapping performed on a hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer with high mass range

Význam tématu

Antibody-drug conjugates představují perspektivní skupinu bioterapeutik kombinujících specifickou vazbu monoklonálních protilátek s cytotoxickými látkami. Jejich komplexní složení vyžaduje vysoce přesné analytické metody pro stanovení průměrného poměru lék-protilátka (DAR) a lokalizaci míst konjugace. Integrace nativní intact mass analýzy a peptide mappingu na jednom přístroji umožňuje komplexní pohled na heterogenitu ADC a zlepšuje rychlost i spolehlivost charakterizace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat integrovanou charakterizaci lysinově vázaného ADC trastuzumab emtansine kombinací:

• nativní intact mass analýzy pro určení distribučního rozsahu DAR a glykoform,
• peptide mappingu s HCD fragmentací pro lokalizaci míst konjugace DM1 a linker-only modifikací.

Analýzy byly provedeny na hybridním kvadrupol-Orbitrap spektrometru se širokým m/z rozsahem.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Q Exactive Plus v režimu High Mass Range (m/z až 8000)
• Online size exclusion chromatography (SEC) a reverzní fáze (RP) LC pro nativní a denaturační přístup
• BioPharma Finder 2.0 s dekonvolučním algoritmem ReSpect
• Systém SMART Digest pro přípravu peptidů
• MassAnalyzer algoritmus pro vyhledávání modifikací

Použitá metodika

ADC vzorek byl analyzován bez předúpravy pro nativní intact MS a pro peptide mapping. Pro intact analýzu bylo prováděno online desalting pomocí SEC či RP LC a následný MS scan:

• rozlišení MS1 17 500 až 70 000, 10 microscans
• skenování m/z 200–8000 pro nativní režim
• dekonvoluce intact spekter v BioPharma Finder pomocí ReSpect

Peptide mapping proběhl v triplikátech:

• trypsinová digestace SMART Digest
• RP gradient 60 minut, rozlišení 70 000
• HCD fragmentace a manuální vyhledávání modifikací s tolerancí 5 ppm

Hlavní výsledky a diskuse

Intact nativní MS odhalilo distribuční rozsah 0–8 přidaných linker-drug jednotek s průměrným DAR 3,65. Kromě očekávaných glykoform G0F/G1F a G1F/G1F se objevila třetí vrstva heterogenity odpovídající linker-only modifikacím (přírůstek ~220,8 Da). Peptide mapping dosáhl 100% sekvenční pokrytí a lokalizoval 22 ze 44 lysinových míst s MCC-DM1 konjugací, navíc identifikoval 3 lysiny modifikované pouze linkerem. Konjugované peptidy vykazovaly prodlouženou retenci a dvojí eluce způsobenou stereocentrem DM1. HCD spektra poskytla signature fragmenty, jež lze využít pro cílené vyhledávání neočekávaných konjugovaných peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

Integrovaný přístup umožňuje na jednom Orbitrapu provést kompletní charakterizaci ADC: rychlé stanovení DAR, profiling glykoform a přesnou lokalizaci míst konjugace. Tato kombinace zvyšuje efektivitu laboratorních workflow, zkracuje čas analýzy a zlepšuje validitu výsledků při výrobě a kontrole kvality biofarmaceutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj nativních MS metod včetně přidání iontové mobility pro lepší separaci izobarických forem, zvýšení rozlišení pro přesnější stanovení modifikací a automatizace datové analýzy. Metoda se může rozšířit na další typy biokonjugátů a rutinní kontrolu výroby ADC v biopharmaceutickém průmyslu.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace nativní intact mass analýzy a peptide mappingu na jednom přístroji poskytuje komplexní a vysoko kvalitní charakterizaci lysinově vázaných ADC. Metoda umožňuje přesné stanovení DAR, identifikaci glykoform a lokalizaci míst konjugace, což přispívá k optimalizaci vývoje a kontroly bioterapeutik.

Reference

1. Marcoux J, Champion T, Colas O, Wagner-Rousset E, Corvaïa N, Van Dorsselaer A, Beck A, Cianférani S. Native mass spectrometry and ion mobility characterization of trastuzumab emtansine, a lysine-linked antibody drug conjugate. Protein Sci. 2015 Aug;24(8):1210-23
2. Luo Q, Chung HH, Borths C, Janson M, Wen J, Joubert MK, Wypych J. Structural Characterization of a Monoclonal Antibody-Maytansinoid Immunoconjugate. Anal Chem. 2016 Jan 5;88(1):695-702