The influence of silica pore size and particle size on insulin - a small molecule of protein separation

Význam tématu

Optimalizace separace inzulinu, malého proteinu o hmotnosti ~5800 Da, je klíčová pro rychlou a spolehlivou analýzu v kontrolách kvality, výzkumu i regulačních aplikacích. Výběr správného pórového a částicového uspořádání reverzní fáze značně ovlivňuje účinnost, čas zadržení a tvar píků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo systematicky porovnat vliv velikosti pórů (80 Å, 95 Å, 120 Å, 170 Å, 300 Å) a velikosti částic (5 µm, 3,5 µm, 1,8 µm a 2,7 µm povrchově porézních) různých C18 kolon na separaci porciního inzulinu a jeho A21 desamido formy. Studie hodnotila retenci, efektivitu a tvar píků při zachování farmakopejních parametrů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separace byl použit systém Agilent 1200 SL LC s binárním čerpadlem, termostatovanou kolonovou komorou, autosamplerem a DAD detektorem při vlnové délce 214 nm. Mobilní fáze byla isokratická: 74 % fáze A (0,2 mol/l síran + kyselina fosforečná upravená na pH 2,3) a 26 % fáze B (acetonitril), průtok 1,0 ml/min, teplota 40 °C, objem injekce 20 µl.

• Testované kolony: Agilent ZORBAX SB-C18 (80 Å, 95 Å), ZORBAX Eclipse Plus C18, ZORBAX 300SB-C18, Agilent Poroshell 120 SB-C18, Poroshell 120 EC-C18, Agilent TC-C18(2).
• Parametry: gradient neměnný, isokratický provoz, UV detekce 214 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Kolony s póry menšími než 100 Å omezovaly přístup inzulinu do vnitřních porů a vykazovaly prodloužené zadržení a nižší efektivitu. Póry ≥100 Å (120 Å, 300 Å) a povrchově porézní částice 2,7 µm výrazně zlepšily difuzi a dvojnásobně navýšily efektivitu oproti 80 Å.

• Zvýšení podílu organiky o 1,5 % snížilo retenční čas na TC-C18(2) z 44 min na 15 min při zachování dobrého tvaru píků.
• Nejvyšší povrchová plocha TC-C18(2) přinesla největší retenci a nejlepší tvar píků díky kompletnímu přístupu k vázané fázi.
• Kolony s částicemi 1,8 µm vykázaly vyšší efektivitu, ale za cenu vyššího provozního tlaku.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaná metoda umožňuje rychlé a efektivní stanovení inzulinu i jeho modifikovaných forem v rutinním QA/QC a vývojových laboratořích. Volba kolony s póry ≥120 Å zkracuje čas analýzy a snižuje spotřebu organiky při zachování požadované účinnosti.

• Vyšší propustnost a menší běh času při použití 2,7 µm povrchově porézních částic.
• Splnění farmakopejních požadavků USP a Čínské farmakopey.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj povede k nasazení sub-2 µm povrchově porézních materiálů a nových modifikovaných stacionárních fází. Integrace UHPLC systémů umožní další zkrácení analýzy, zatímco mikrofluidní přístupy mohou optimalizovat spotřebu vzorku a rozpouštědel. Metodu lze dále adaptovat na jiné peptidy a malé proteiny v biopharmaceutické analytice.

Závěr

Pro separaci inzulinu se nejlépe osvědčily kolony s póry ≥100 Å, zejména Poroshell 120 SB-C18 (120 Å, 2,7 µm) a Agilent TC-C18(2) (300 Å, 5 µm). Kombinace větší pórů a menších částic poskytuje optimální poměr účinnosti, retence a provozního tlaku, přičemž splňuje požadavky regulačních norem.

Reference

• China Pharmacopoeia (2010 edition), insulin, s. 845–846.
• United States Pharmacopoeia USP 31 (vol 2), Insulin, s. 2403–2404.
• Phu T. Duong, Analysis of Oxidized Insulin Chains using Reversed Phase Agilent ZORBAX RRHD 300 SB-C18, Agilent application note 5990-7988EN.