Development of high sensitivity and separation detection method for ciguatoxin analogues by LC/MS

Význam tématu

Ciguatera fish poisoning je nejrozšířenější forma potravinové otravy způsobená ciguatoxiny polyetherovými neurotoxiny v rybách. I stopová množství CTX se při senzitivních metodách detekce na úrovni 0.2 µg/kg představují riziko pro lidské zdraví. Regulátoři FDA a EFSA stanovili mezní hodnotu 0.01 µg ekv. CTX1B/kg. Vysoce citlivé a selektivní analytické metody jsou proto klíčové pro kontrolu kvality rybího masa.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo optimalizovat LC/MS/MS metodu pro detekci a kvantifikaci devíti CTX analogů na stopových úrovních. Studie se zaměřila na vytvoření vysoce citlivého režimu aduktů s Na+ a Li+ a na vylepšení chromatografické separace a reproducibility pomocí běžně dostupného LC/MS/MS přístroje.

Použitá metodika a instrumentace

• Přístrojová sestava: LCMS-8060NX v kombinaci s UHPLC Nexera X3 (Shimadzu).
• Mobilní fáze: voda s 5 mM amonnému formiátu a 0.1 % kyseliny formiové ve směsných poměrech gradientu.
• Přídavek stopového množství Na+ nebo Li+ pro tvorbu aduktů [M+Na]+ a [M+Li]+.
• MRM režim pro specifické prekurzor produkt ionty jednotlivých CTX analogů.
• Ověřovací standardy: JFRL qNMR referenční materiály a směs devíti CTX od NIHS.

Hlavní výsledky a diskuse

• Při aplikaci Li+ aduktů bylo dosaženo vyšší citlivosti než s [M+Na]+, u některých analogů [M+Na]+ signál chyběl.
• Optimální kolizní energie (CE) byla stanovena individuálně pro každý analog s cílem maximalizovat poměr signál šum.
• Lineární kalibrační křivky měly koeficient determinace R2 0.9999 v rozsahu 0.0005 až 0.02 ng/mL.
• Limity kvantifikace (LOQ) odpovídají 0.0004–0.0012 µg/kg při extrakci z 5 g rybího masa.
• Chromatografická separace devíti analogů byla výrazně zlepšena v porovnání s publikovanými podmínkami, zejména u složitých párů isomerů.
• Metoda vykázala opakovatelnost a přesnost 100 ± 5 % při třech opakováních.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost detekovat CTX pod stanovenou regulační úrovní FDA.
• Využití obyčejných LC/MS/MS přístrojů bez nutnosti specializovaných modulů.
• Vhodné pro rutinní kontrolu kvality rybího masa v potravinářských laboratořích a regulačních agenturách.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Implementace do programů monitoringu mořských toxinů v globálním měřítku.
• Rozšíření metody o nové CTX analogie a další fosfolipidové toxiny.
• Automatizace vzorkových příprav a vysokoprůchodový screening.
• Integrace s datovými platformami LIMS pro sledování historie vzorků.

Závěr

Optimální aduktace Li+ umožnila citlivou detekci devíti CTX analogů s LOQ až 0.0004 µg/kg a vynikající chromatografickou separací. Metoda je robustní, reprodukovatelná a splňuje regulatorní požadavky FDA EFSA. Přístrojové konfigurace běžných výrobců lze standardně využít pro laboratorní analýzy CTX.

Reference

• Yogi K et al Detailed LC-MS/MS analysis of ciguatoxins revealing distinct regional and species characteristics in fish and causative alga from the Pacific Anal Chem 2011 83 8886-8891
• Kato T Yasumoto T Quantification of Representative Ciguatoxins in the Pacific Using Quantitative Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Mar Drugs 2017 15 309
• Wu JJ et al Validation of an accelerated solvent extraction LC-MS/MS method for Pacific ciguatoxin-1 in fish flesh Anal Bioanal Chem 2011 400 3165-3175
• Klijnstra M Gerssen A A Sensitive LC-MS/MS Method for Palytoxin Using Lithium Cationization Toxins 2018 10 537
• Oshiro N et al Analytical Studies on Ciguateric Fish in Okinawa Japan II The Grouper Variola albimarginata J Mar Sci Eng 2023 11 242