High sensitivity and separation detection method for ciguatoxin analogues using Li adduct ion by LC-MS/MS

Význam tématu

Ciguatera je nejrozšířenější forma potravinové otravy způsobená ciguatoxiny, neurotoxickými polyetherovými sloučeninami produkovanými bentickými dinoflageláty. Díky své termostabilitě a schopnosti vyvolat symptomy při koncentracích od 0,2 µg/kg představují CTX značné riziko pro veřejné zdraví. Regulátoři, včetně FDA a EFSA, proto doporučují kontrolní úroveň 0,01 µg ekvivalentu CTX1B/kg.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na vývoj vysoce citlivé metody LC-MS/MS pro stanovení analog ciguatoxinů kombinací sodného ([M+Na]+) a lithiového ([M+Li]+) aduktu. Cílem bylo dosáhnout detekční limity odpovídající doporučením FDA a EFSA při současném zlepšení chromatografické separace devíti klíčových CTX analogů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a detekci bylo použito UHPLC Nexera™ X3 spojené s triple-quadrupole hmotnostním spektrometrem LCMS-8060NX (Shimadzu Corporation). Mobilní fáze s přídavkem stopového množství Na+ nebo Li+ umožnila tvorbu příslušných aduktů. Detekce probíhala v režimu MRM se specifickým laděním energie kolize (CE) optimalizovanou pro každý analog. Jako referenční materiály byly využity qNMR-kvantifikované standardy od JFRL a směs CTX standardů připravená NIHS.

Hlavní výsledky a diskuse

• Při přídavku Li+ se [M+Li]+ adukty tvořily preferenčně a eliminovalo se [M+Na]+, což vedlo k výraznému navýšení citlivosti.
• Optimalizace CE ukázala, že nejvyšší poměr signálu k šumu (S/N) poskytují specifické hodnoty pro každý analog (např. CTX1B při CE 45 V).
• Chronatografická separace devíti analyzovaných CTX analogů byla v Li-náplni kompletní a lepší než v původně publikovaných podmínkách bez alkalií.
• Limity kvantifikace (LOQ) stanovené z kalibračních křivek se pohybovaly v rozmezí 0,0004–0,0012 µg/kg při extrakci z 5 g rybího masa, což splňuje či výrazně překračuje požadavky FDA.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost rutinního monitoringu CTX v mořských plodech na úrovni požadovaných regulačních limitů.
• Vysoká specifičnost a citlivost umožňuje minimalizovat falešně negativní výsledky.
• Platforma LCMS-8060NX od Shimadzu je dostupná v mnoha laboratořích, metoda je proto snadno implementovatelná.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody o další marine toxinové třídy pro komplexní screening kontaminant.
• Nasazení vysokého rozlišení hmotové spektrometrie (HRMS) pro potvrzení struktur nových CTX analogů.
• Automatizované extrakční a připravné postupy pro zvýšení throughput v rutinním provozu.
• Vývoj miniaturizovaných přenosných LC-MS systémů pro terénní analýzy.

Závěr

Optimalizovaná metoda LC-MS/MS s použitím lithiového aduktu poskytuje vynikající citlivost a chromatografickou separaci ciguatoxinů, splňuje regulatorní požadavky a je realizovatelná na běžně dostupných analytických platformách. Tento přístup významně zvyšuje spolehlivost monitoringu CTX v potravinářských i environmentálních vzorcích.

Reference

1. Yogi K., Oshiro N., Inafuku Y., Hirama M., Yasumoto T. Detailed LC-MS/MS analysis of ciguatoxins revealing distinct regional and species characteristics in fish and causative alga from the Pacific. Anal. Chem. 2011, 83, 8886–8891.
2. Kato T., Yasumoto T. Quantification of Representative Ciguatoxins in the Pacific Using Quantitative Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Mar. Drugs 2017, 15, 309.
3. Wu J. J. et al. Validation of an accelerated solvent extraction LC-MS/MS method for Pacific ciguatoxin-1 in fish flesh and comparison with the mouse neuroblastoma assay. Anal. Bioanal. Chem. 2011, 400, 3165–3175.
4. Klijnstra M. D., Gerssen A. A Sensitive LC-MS/MS Method for Palytoxin Using Lithium Cationization. Toxins 2018, 10(12), 537.
5. Oshiro N. et al. Analytical Studies on Ciguateric Fish in Okinawa, Japan (II): The Grouper Variola albimarginata. J. Mar. Sci. Eng. 2023, 11, 242.