Characterization of Released N-linked Glycans in Biosimilar mAb Drug Products Using the Xevo™ G3 QTof

Význam tématu

Glykosylace ovlivňuje imunogenicitu, biologickou aktivitu a farmakokinetiku monoklonálních protilátek. U biosimilárních mAb se i při stejné sekvenci aminokyselin mohou objevovat rozdíly v glykánových profilech, což vyžaduje detailní charakterizaci před uvolněním léku na trh.

Cíle a přehled studie

Tato studie se zaměřuje na porovnání N-vázaných glykánů u originátoru infliximabu (Remicade) a jeho biosimiláru (Renflexis). Cílem je demonstrovat využití hmotnostního spektrometru Xevo G3 QTof ve spojení s označením GlycoWorks RapiFluor-MS, HILIC chromatografií a softwarovým nástrojem waters_connect k získání citlivého, kvantitativního a strukturálního přehledu glykoformací.

Použitá metodika

Postup zahrnuje enzymatické uvolnění N-vázaných glykánů z mAb, jejich značení reagencí RapiFluor-MS a separaci pomocí HILIC UPLC. Detekce probíhá paralelně fluorescenčně i hmotnostně. Data se zpracovávají přes UNIFI aplikaci v rámci waters_connect platformy.

Použitá instrumentace

• UPLC systém: ACQUITY Premier BSM
• Kolona: ACQUITY Premier Glycan BEH Amide, 1.7 µm, 2.1 × 150 mm
• Fluorescenční detektor: ACQUITY Premier FLR (λexc 265 nm; λem 425 nm)
• MS: Xevo G3 QTof (ESI+; m/z 100–2000; kapilární 3.0 kV; kolizní energie 6 V nízká, 15–40 V rampa; teplota zdroje 120 °C; desolvace 300 °C; plyn desolvace 800 L/h)
• Software: waters_connect s UNIFI App (verze 3.1.0.16)

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání chromatogramů ukázalo rozdíly ve vybraných glykoformách:

• Originátor (Remicade) vykazoval vyšší zastoupení NeuGc sialylovaných glykánů
• Biosimilární produkt (Renflexis) měl převahu NeuAc glykánů
• Rozdíly byly patrné i u vysokomannózových forem (M5, M6) a anténárních struktur (mono- a bi-antennární glykoformy)

Elevated energy MSE a cílené MS/MS fragmentační spektra umožnila potvrzení monosacharidové skladby a vazeb mezi jednotkami, přestože některé isomery vyžadují další techniky pro určení stereochemie.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a specifita detekce nízkoodstupňových glykánů
• Alternující nízko- a vysoké energie (MSE) pro hloubkovou strukturální analýzu
• Široká kompatibilita s automatizovaným workflow a softwarovou integrací pro rychlou komparativní analýzu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávaný rozvoj zahrnuje:

• Začlenění iontově mobilní spektrometrie pro lepší separaci izomerů
• Využití strojového učení pro rychlejší a přesnější identifikaci glykoformací
• Prodloužení aplikace na další post-translační modifikace a vysoce propustné screeningy

Závěr

Workflow kombinující označení GlycoWorks RapiFluor-MS, HILIC UPLC a Xevo G3 QTof hmotnostní spektrometr poskytuje citlivou a detailní charakterizaci N-vázaných glykánů u biosimilárních mAb. Tato metodika podporuje důkladnou komparativní analýzu originálu a biosimilárního produktu, čímž přispívá k zajištění bezpečnosti a účinnosti léčiv.

Reference

1. Faid V, Leblanc Y, Berger M, Seifert A, Bihoreau N, Chevreux G. C-terminal Lysine Clipping of IgG1: Impact on Binding to Human FcγRIIIa and Neonatal Fc Receptors. Eur J Pharm Sci. 2021;159:105730.
2. Zhang P et al. Challenges of Glycosylation Analysis and Control: An Integrated Approach to Producing Optimal and Consistent Therapeutic Drugs. Drug Discov Today. 2016;21(5):740–765.
3. Lauber M et al. Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent that Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection. Anal Chem. 2015;87(10):5401–5409.
4. Lambert P et al. Robust Automated High-Throughput N-Glycan Analysis Using the GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit for Automation. Waters Application Note. 2018.
5. Yu YQ. Released N-linked Glycan Analysis Using the Glycan Application Solution with UNIFI. Waters Tech. Brief. 2016.
6. DeLaney K, Htet Y, Yu YQ. Comparison of Released N-Glycans in Biosimilar mAb Drug Products using the BioAccord LC-MS System. Waters Application Note. 2023.