TWO-DIMENSIONAL LIQUID CHROMATOGRAPHY - PRINCIPLES, PRACTICAL IMPLEMENTATION AND APPLICATIONS

Význam tématu

Analýza složitých směsí v řádu desítek až stovek komponent vyžaduje vyšší separační výkon než poskytuje konvenční jednorozměrná kapalinová chromatografie (1D-LC). Dvourozměrná LC (2D-LC) rozšiřuje separační prostor kombinací dvou navzájem ortogonálních separačních mechanismů, což při optimálním návrhu zvyšuje teoretickou kapacitu oddělení násobným součinem kapacit obou dimenzí. Díky pokroku v kolónové technologii (sub-2 µm, core-shell) a čerpadlech s vysokým průtokem a nízkými objemy zpoždění (< 100 µL) lze dnes plně on-line 2D-LC provést během desítek minut.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem textu je poskytnout komplexní přehled principů, konstrukčních předpokladů, optimalizačních strategií a hlavních aplikací 2D-LC. Popisuje historický vývoj, nástroje pro návrh a kvantitativní odhad kapacity, způsoby provedení (comprehensive vs. heart-cut), nároky na instrumentaci a metody analýzy získaných dat.

Použitá metodika a instrumentace

• Comprehensive 2D-LC (LC×LC) – kontinuální sběr dílčích frakcí 1D kolony, jejich modulace (< 2–20 s cykly) a rychlý gradient v 2D.
• Heart-cutting 2D-LC – cílené frakcionování vybraných zón 1D kolony do 2D pro detailní rozlišení.
• Čerpadla s nízkým objemem zpoždění (< 100 µL) pro optimalizaci rychlosti a opakovatelnosti 2D gradientů.
• Kolony 2D: krátké (30–50 mm), úzké (2,1 mm), částice 1,8 µm/core-shell, provoz až 4 mL/min při 60–100 °C.
• Optimalizační modely – Poppeho a linie efektivity pro optimální volbu délky, průměru, velikosti částic a rychlosti eluentu tak, aby se maximalizovala kapacita při omezené době cyklu.
• Analýza dat – baseline‐subtrakce (OBGC), šumová prahová detekce, třídění signálů, slučování 2D‐dceřiných píku, výpočet objemu složených píku.

Hlavní výsledky a diskuse

• Teoretický model ukazuje, že efektivní kapacita 2D-LC překoná 1D-LC již ve 20–30 min rozboru při optimálním 2D cyklu ~12 s (sampling time), fcov≥0.6 a produktivitě 2 pík/s.
• Při výrazném podvzorkování 1D (ts≫4σ) ovlivňuje efektivní kapacitu především 2D cyklus, nikoli kapacita 1D.
• Posunové gradienty ve 2D („shifted gradients“) významně zvyšují obsazenost plochy 2D chromatogramu, redukují nevyužité oblasti a zvyšují csov.
• Při cílených aplikacích heart-cutting 2D-LC odhalí skryté impurity, u komplexních směsí (proteiny, polyfenoly, přírodní extrakty) zajišťuje dostatečnou selektivitu a citlivost.

Přínosy a praktické využití metody

• Biotechnologie/proteomika – rozlišení proměnlivých tryptických peptidů, post-translačních modifikací (SCX×RP, HILIC×RP).
• Farmacie – identifikace degradací a impurit fotocitlivých API; QC stability studií; vysoká průchodnost i pro cílené analýzy (heart-cutting).
• Potravinářství – profiling polyfenolů ve víně, pivu, ovocných šťávách; analýza tuků/terpenů v olejích (NP×RP, Arg×RP).
• Polymery – charakterizace kopolymerů, distribuce homologů (SEC×RP, RP×RP).
• Environment – screening biostimulantů, TCM extraktů, pesticidních reziduí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Implementace ultrarychlých 2D-LC modulací (5–10 s cykly) s pumpami bez zpožďovacích objemů & MS detekcí bez dělících ventilů.
• Rozvoj škálovatelných automatizovaných metod pro méně zkušené uživatele a robustní softwarové nástroje – baseline correction, automatická detekce a kvantifikace píku, chemometrické řešení GC×GC–LC×LC dat (PARAFAC, GRAM).
• Modernizace tréninku uživatelů a standardizace metod; otevřený přístup k výukovým nástrojům a databázím sloupcových vlastností (HSM).
• Využití 2D-LC jako univerzálního analytického “enginu” pro rychlé QC analýzy malých počet složek s minimem vývoje metod.

Závěr

2D-LC představuje zásadní pokrok v oblasti separační vědy pro analýzu vzorků střední i vysoké složitosti. Komplexní LC×LC se svými vysokými kapacitami umožňuje detekci a kvantifikaci skrytých látek v reálných časových oknech do 30 min. Heart-cutting metody zase cílí na klíčové frakce pro rychlé rozlišení kritických impurit. Hlavní výzvou i nadále zůstává optimalizace metod a analýza 2D dat, avšak rychlý rozvoj hardwaru a chemometrických algoritmů slibuje další rozšíření a zjednodušení použití 2D-LC.

Reference

• Y. Huang et al., Anal. Chem. 2011, 83, 9531.
• D.R. Stoll et al., J. Chromatogr. A 2006, 1122, 177.
• P.J. Marriott, P. Schoenmakers et al., LC-GC Eur. 2012, 266.
• J.C. Hoggard, R.E. Synovec, Anal. Chem. 2007, 79, 1611.
• M.R. Filgueira et al., Anal. Chem. 2012, 84, 6747.
• P.W. Carr, D.R. Stoll, Anal. Chem. 2009, 81, 5342.
• J.M. Davis, D.R. Stoll, P.W. Carr, Anal. Chem. 2008, 80, 461.