Monoclonal Antibody (mAb) Intact Mass and Subunit Analysis Using Shimadzu Q-TOF LCMS-9030

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují klíčovou skupinu bioterapeutik využívaných při léčbě onkologických a imunitně podmíněných onemocnění. Jejich molekulární charakterizace je nezbytná pro zajištění kritických parametrů kvality (CQA) v průběhu vývoje a schvalování léčiv. Díky své vysoké hmotnosti, strukturní komplexitě a heterogenitě vyžadují mAb pokročilé analytické metody k identifikaci modifikací a potvrzení integrity produktu.

Cíle a přehled studie

Cílem popsané práce je demonstrovat rychlý a přímý pracovní postup pro celkovou hmotnost (intact mass) a subunit analýzu mAb za použití vysoce výkonného Q-TOF hmotnostního spektrometru Shimadzu LCMS-9030. Studie popisuje postup vzorkové přípravy, chromatografické a spektrometrické podmínky a následnou datovou analýzu pro přesné stanovení molekulární hmotnosti těla protilátky a jejích rozštěpených podjednotek.

Použitá metodika a instrumentace

Pro intact mass analýzu byla mAb NISTmAb 8671 ředěna na 0,1 mg/ml v 0,1 % kyselině mravenčí a injektována do LCMS-9030 Q-TOF se sloupcem Shim-pack Scepter C4 (2,1×150 mm, 1,9 µm). Subunit analýza zahrnovala denaturaci a redukci disulfidických vazeb TCEP, následnou deglykosylaci Rapid PNGase F a opětovnou chromatografii za stejných podmínek. Spektrální data byla dekonvoluována softwarem Protein Metrics.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza celkové hmotnosti potvrdila přesnost do 20 Da od očekávané teoretické hmotnosti pro různé glykofor­mace a modifikace. Subunit analýza jednoznačně identifikovala lehký a těžký řetězec s adipózními, oxidativními a glykacími modifikacemi. Čisté TIC profily i dekonvoluovaná spektra prokázala stabilní rozlišení více nabitých iontových stavů a vysokou reprodukovatelnost měření.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a jednoduchá workflow pro QC a vývoj mAb.
• Možnost detekce posttranslačních modifikací a chyb v disulfidických vazbách.
• Vysoké rozlišení a přesnost hmotnostních měření pro potvrzení kvality bioléčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření middle-down a top-down přístupů, integrace automatizované přípravy vzorků a využití strojového učení pro rychlejší interpretaci komplexních hmotnostních dat. Vyvíjí se také hardware s ještě vyšším rozlišením a citlivostí pro rozlišení izobarických modifikací.

Závěr

Popisovaný postup potvrzuje, že kombinace Shimadzu LCMS-9030 Q-TOF a softwaru Protein Metrics poskytuje robustní a efektivní nástroj pro komplexní charakterizaci intact mass a subunit analýzy mAb. Metoda umožňuje spolehlivé stanovení molekulární hmotnosti a detekci kritických modifikací během vývoje bioléčiv.

Reference

1. Srzentić S et al. Interlaboratory study for characterizing Monoclonal Antibodies by Top-Down and Middle-Down Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom 31(9):1783–1802 (2020)
2. Robotham AC, Kelly JF. LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: recent highlights and future prospects. In: Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics. Elsevier, 2020;1–33