Simultaneous Analysis of Hydrophilic Metabolites in Feces Using a Single Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza metabolit ve stolici umožňuje sledovat vliv střevní mikrobioty na zdraví hostitele a odhalit souvislosti s nemocemi či účinností léčiv. Hydrofobní i hydrofilní metabolity, jako jsou krátké mastné kyseliny, aminokyseliny a organické kyseliny, jsou klíčové indikátory interakcí mezi bakteriemi a hostitelem. Jednoduché a účinné metody pro jejich současné stanovení zvyšují rychlost a šíři biologických studií v mikrobiálním výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ověřit možnosti jediného kvadrupólového LC-MS pro široce cílenou analýzu hydrofilních metabolit ve vzorcích stolice. Studie popisuje:

• Současné stanovení až 143 cílových sloučenin včetně aminokyselin, organických kyselin, nukleosidů a nukleotidů.
• Jednoduchou předúpravu vzorku stolice včetně extrakce, ultrafiltrace a ředění s interním standardem.
• Statistickou analýzu dat pomocí multivariačního přístupu pro detekci charakteristických markerů.

Použitá metodika a instrumentace

V předúpravě bylo z 100 mg stolice přidáno 700 µl pufrované soli (PBS), vzorek se promíchal, odstředil a ultrafiltrátem se analyzoval po ředění s MES jako interním standardem. Instrumentace zahrnovala:

• Nexera XR HPLC se sloupcem Shim-pack GIST PFPP, gradientní eluce s načasovanou rychlostí a mobilem fází A (0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě) a B (0,1 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu).
• Single kvadrupólový hmotnostní spektrometr LCMS-2050 s DUIS zdrojem kombinujícím ESI a APCI, režimy pozitivní a negativní ionizace, SIM detekce 143 událostí.
• Multi-omics Analysis Package pro multivariační statistiku, zejména PCA na poměrech plochy píku ke standardu.

Hlavní výsledky a diskuse

Z celkem 143 sledovaných sloučenin bylo v analýze detekováno 66 metabolitů. Nejčastější byly aminokyseliny, organické kyseliny a nukleosidové metabolity. Počet detekovaných sloučenin se lišil podle vzorku (44–55). PCA ukázala jasné skupiny podle místa sběru stolice tří skupin opic. S1 charakterizovaly vyšší hladiny GABA, carnitinu a cholinu, S2/S3 purinové metabolity (xanthin, hypoxanthin) a S4/S5 organické kyseliny (citrát, kyselina kávová). Tyto rozdíly pravděpodobně odrážejí odlišné diety a prostředí jednotlivých tlup.

Přínosy a praktické využití metody

• Nižší cena a jednodušší obsluha oproti triplekvadrupólovým systémům.
• Rychlá a robustní současná detekce širokého spektra hydrofilních metabolit.
• Vhodné řešení pro laboratoře s omezenými zkušenostmi s hmotnostní spektrometrií.
• Integrovaná analýza dat usnadňuje identifikaci biologicky významných markerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření použití jediného kvadrupólu pro multitarget metabolomiku v mikrobiálních studiích, potravinovém výzkumu a klinickém sledování. Vývoj lepších kolonek a výkonnějších datových balíčků umožní ještě širší pokrytí metabolitů, včetně lipofilních sloučenin, a pokročilé integrace s dalšími „omics“ platformami.

Závěr

Metoda pro současné stanovení hydrofilních metabolit ve stolici pomocí jediného kvadrupólového LC-MS byla úspěšně implementována. Nabízí jednoduché, cenově dostupné a robustní řešení pro široce cílené metabolomické studie mikrobioty.

Reference

1. Tsuchida S., Hattori T., Sawada A., Ogata K., Watanabe J., Ushida K.: Fecal metabolite analysis of Japanese macaques in Yakushima by LC-MS/MS and LC-QTOF-MS. Journal of Veterinary Medical Science, 83(6):1012–1015, 2021.