Analysis of Short-Chain Fatty Acids and Organic Acids in Feces Using a Single Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Lidské střevo obsahuje rozmanitou komunitu bakterií, jejichž metabolity, především krátké mastné kyseliny a organické kyseliny, významně ovlivňují zdraví hostitele. Analýza těchto sloučenin ve vzorcích stolice umožňuje lepší pochopení vlivu střevní mikrobioty na metabolismus, imunitní systém a riziko onemocnění.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit citlivou metodu pro kvantifikaci šesti krátkých mastných a šestnácti organických kyselin ve vzorcích opičí stolice pomocí jediného kvadrupólu LC-MS systému LCMS-2050. Studie zahrnovala přípravu vzorků, derivatizaci, chromatografickou separaci a hmotnostní detekci.

Použitá metodika a instrumentace

Popis metodiky:

• Odběr a skladování: Stolice od pěti makaků z různých lokalit byla rychle zamrazena při −80 °C.
• Příprava vzorků: Extrakce v methanolově-vodném roztoku se s 0,1 % kyselinou mravenčí, ultrafiltrace a pětinásobné naředění.
• Derivatizace: Použity 3-nitrofenylhydrazin, pyridin a EDC pro zvýšení retence a citlivosti.
• Chromatografické podmínky: Kolona C18, gradientní eluce s vodnou fází a acetonitrilem, průtok 0,35 mL/min, objem injekce 3 µL.
• Hmotnostní detekce: LCMS-2050 s DUIS (ESI/APCI), režim SIM pro 23 událostí.

Použitá instrumentace:

• Nexera XR a LCMS-2050 single kvadrupól (Shimadzu).
• Kolona Mastro 2 C18 (2,0×150 mm, 3 µm).
• Vortex, centrifuga, ultrafiltrační filtry MWCO 3000.

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda umožnila detekci 21 cílených sloučenin se schopností rozlišit izomery (isobutyrát/butyrát, isovalerát/valerát).
• Opakovatelnost: %RSD retence a plochy byla většinou pod 5 %, což potvrzuje vysokou reprodukovatelnost.
• Profil S1 se lišil vyššími hladinami pyruvátu, laktátu a α-ketoglutarátu a nižšími hladinami acetátu, propionátu a butyrátu.
• Vzorky S2 a S3 zaujaly podobné pozice v analýze hlavních komponent díky stejnému stravování, zatímco S4 a S5 vykázaly rozdíly ovlivněné dietou a mikrobiotou.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou citlivost a selektivitu detekce nízkých koncentrací mastných a organických kyselin.
• Možnost komplexního metabolického profilu střevní mikrobioty.
• Jednoduchost a cenovou dostupnost single kvadrupólového LC-MS, vhodnost pro méně zkušené operátory.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření analýzy na další metabolity a integrace do multi-omických přístupů.
• Využití v klinickém výzkumu onemocnění spojených se střevní mikrobiotou.
• Aplikace ve vývoji funkčních potravin nebo probiotik zaměřených na modulaci střevního prostředí.
• Automatizace předúpravných kroků a zlepšení citlivosti s využitím pokročilejších ionizačních technik.

Závěr

Vyvinutá metoda pro analýzu krátkých mastných a organických kyselin pomocí single kvadrupólového LC-MS prokázala vysokou citlivost, reprodukovatelnost a schopnost rozlišit izomery. Díky jednoduchosti ovládání a cenové dostupnosti představuje vhodný nástroj pro výzkum střevní mikrobioty a její vliv na zdraví.

Reference

• S. Tsuchida et al. Fecal metabolite analysis of Japanese macaques in Yakushima by LC-MS/MS and LC-QTOF-MS, J Vet Med Sci., 83(6), 1012–1015 (2021).
• Application News No. eL555: Improvement of Productivity in Research on Intestinal Microbiota by Shim-pack Fast-OA High-Speed Organic Acid Analysis Column.
• Application News No. 01-00600-EN: Simultaneous Analysis of Hydrophilic Metabolites in Feces Using a Single Quadrupole Mass Spectrometer.