Method Development of Synthetic Triphenylmethane Dyes Using MaxPeak™ Premier Columns on an Alliance™ HPLC™ System

Význam tématu

Metoda oddělení syntetických triphenylmethanových barviv v kapalinové chromatografii má klíčový význam pro průmyslové a výzkumné aplikace, kde je nutné přesné a reprodukovatelné rozlišení strukturálně podobných sloučenin. Použití strukturovaného přístupu k vývoji metod zkracuje dobu vývoje a poskytuje jasnou stopu rozhodnutí, což usnadňuje práci méně zkušeným analytikům a zvyšuje spolehlivost výsledků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout HPLC metodu pro kompletní separaci osmi triphenylmethanových barviv se společným kostrou a odlišnými substituenty. K tomu byl aplikován Systematický Screeningový Protokol ve čtyřech krocích spolu s kolonami MaxPeak Premier vybavenými High-Performance Surfaces technologií, která minimalizuje nespecifické adheze analyty–zpevňovač.

Použitá metodika a instrumentace

Systematický Screeningový Protokol zahrnoval:

• Krok 1: Stanovení kritérií metody – úplné rozlišení a symetrie píku.
• Krok 2: Rychlé srovnání retence při nízkém a vysokém pH na BEH C18 koloni, identifikace optimálního pH.
• Krok 3: Výběr vhodných koloni a organických rozpouštědel (acetonitril, methanol) pro porovnání selektivit na třech Premier kolonách.
• Krok 4: Optimalizace finálních podmínek (gradient, přidání pufru) k odstranění nežádoucích interakcí a zlepšení tvaru píků.

Instrumentace:

• Kapalinový chromatograf: Alliance HPLC System s detektorem UV při 260 nm.
• Kolony: XBridge Premier BEH C18 4,6×100 mm, XBridge Premier BEH Phenyl 4,6×100 mm, XSelect Premier CSH C18 4,6×100 mm.
• Mobilní fáze: voda, acetonitril, methanol, přídavek formiátu amonného pH 3.
• Software: Empower 3.

Hlavní výsledky a diskuse

Testy pH ukázaly, že nízké pH poskytuje lepší retenci pro všechny barviva; vysoké pH vedlo k ztrátě retence kyselých sond a rozštěpení píku některých sloučenin. Srovnání mobilních fází methanol vs acetonitril odhalilo, že acetonitril v kombinaci s BEH C18 nejlépe odlišuje kyselé a zásadité sondy. Problémy s tažením píků způsobené iontovými interakcemi základních skupin na BEH částici byly vyřešeny přidáním 10 mM formiátu amonného pH 3, což vedlo k ostrým symetrickým píkům a plné separaci všech osmi barviv pod 20 minut.

Přínosy a praktické využití metody

Nově vyvinutá metoda nabízí:

• Rychlé a reprodukovatelné oddělení komplexu strukturně podobných sloučenin.
• Minimalizaci sekundárních interakcí díky High-Performance Surfaces technologii.
• Jednoduchou stopu rozhodnutí vhodnou pro méně zkušené analytiky.
• Možnost přímého nasazení v rutinní analýze nebo validaci robustnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikace HPS kolon do dalších oblastí, včetně studia termické degradace nebo více matrik. Další vývoj může zahrnovat integraci s hmotnostní spektrometrií pro spolehlivější identifikaci, automatizaci voleb gradientů pomocí umělé inteligence a validaci pro zpřísněné QA/QC normy v potravinářství a farmacii.

Závěr

Systematický Screeningový Protokol ve spojení s MaxPeak Premier kolony umožnil efektivní vývoj HPLC metody pro osm syntetických triphenylmethanových barviv. Metoda poskytuje kompletní separaci, výborný tvar píků a je snadno reprodukovatelná již od prvního injektu.

Reference

1. Hong P, McConville P. A Complete Solution to Perform a Systematic Screening Protocol for LC Method Development. Waters White Paper. 720005268, 2021.
2. Maziarz M, Rainville P. Efficient Method Development for the Analysis of Naphazoline Hydrochloride, Pheniramine Maleate, and Associated Related Substances using a Systematic Screening Protocol. Waters Application Note 720007850, 2023.
3. Method Development of Ten Antibiotic Compounds Using a Systematic Screening Protocol on an ACQUITY Arc with UV and QDa Detection. Waters Application Note 720007352, 2021.
4. Delano M et al. Using Hybrid Organic-Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC. Anal. Chem. 93, 5773–5781, 2021.
5. Walter TH et al. Modifying the Metal Surfaces in HPLC Systems and Columns to Prevent Analyte Adsorption and Other Deleterious Effects. LCGC Supplements, 28–34, 2022.
6. Zabala G et al. Improved Reproducibility for Acetaminophen Assay USP Monograph Using MaxPeak Premier Columns after Modernization to 2.5 µm Particles. Waters Application Note 720007938, 2023.
7. Fountain KJ et al. Practical Applications of Charged Surface Hybrid Technology. Waters Application Note 720003720, 2010.
8. Summers M, Fountain K. Improved Analysis of Goldenseal Root Extract Using Charged Surface Hybrid Technology. Waters Application Note 720004098, 2011.
9. Alden BA et al. Lipid Nanoparticle Compositional Analysis Using Charged Surface Hybrid Phenyl-Hexyl Separation with Evaporative Light Scattering Detection. Waters Application Note 720007331, 2021.