Applying UHPLC-HRAM MS technology to characterize and quantify lipid components in vivo to support new LNP development

Význam tématu

Lipidové nanočástice (LNP) představují klíčovou platformu pro doručování terapeutických mRNA vakcín a dalších biologických látek. Pro vývoj nových, biodegradovatelných ionizovatelných lipidů potřebných k efektivnímu uvolnění nukleových kyselin a rychlé eliminaci produktů degradace je nezbytná citlivá a selektivní analýza lipidních složek a jejich metabolitů přímo v biologických vzorcích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout jedinou LC-MS/MS metodu kombinující datově řízenou (ddMS2) a cílenou (tMS2) analýzu na vysokorozlišovacím Orbitrap Exploris 480 přístroji, která umožní:

• kvantifikaci ionizovatelného lipidu SM-102 v plazmě a tkáních myší v rozmezí 1 pg až 10 000 pg na kolonu,
• současné identifikaci a relativní kvantifikaci biotransformačních produktů lipidu SM-102.

Použitá metodika a instrumentace

Formulace LNP obsahující SM-102, DSPC, cholesterol a PEG-lipid připravená na mikrofluidním mixeru byla dialyzována v PBS pH 7,4. Velikost částic a PDI ověřeno DLS (169 nm, PDI 0,068), účinnost enkapsulace mRNA 96,8 % (fluorescenční assay).
Intramuskulární podání fLuc mRNA-LNP do stehenních svalů BALB/cJ myší, odběr plazmy, jater, sleziny a místního svalu v časech 1, 2, 4, 8 a 24 h po aplikaci. Homogenizace tkání bead mill homogenizérem, extrakce lipidů směsí metanol/chloroform/voda, reaktivace v isopropanol/methanol (50:50).
Chromatografie na Vanquish Horizon UHPLC s Accucore C30 kolonkou (2,1 × 150 mm, 2,6 µm) při 50 °C. Gradient 30–100 % B za 24 min při 0,35 mL/min (A 60/40 ACN/H2O, 10 mM amonný formiát, 0,1 % DFA; B 90/10 IPA/ACN, 10 mM amonný formiát, 0,1 % DFA).
MS analýza na Orbitrap Exploris 480: experimen­t 1 datově závislá ddMS2 (60 000 při m/z 200, AGC 3e6, inj time 100 ms; HCD 15/30/45), experiment 2 cílená tMS2 (30 000 při m/z 200, AGC 1e6, inj time 200 ms, izol okno 2 m/z).

Hlavní výsledky a diskuse

Kvantifikace SM-102:

• lineární rozsah 1–10 000 pg on column, R2 = 0,9938 (vážené 1/x), LOD 1 pg s CV < 5 %,
• fragmenty m/z 300,2173; 318,2280; 472,4003 pro cílenou kvantifikaci, přesnost hmoty < 2 ppm.

Sledování clearance v játrech, slezině a svalu ukázalo rychlý pokles koncentrace SM-102: po 1–2 h pokles v játrech o ~86 %, ve slezině ~99 %. V místě injekce (sval) byla počáteční koncentrace nejvyšší (~13 ng/g) a po 24 h klesla na jednotky ng/g.
Metabolity SM-102 byly identifikovány pomocí Compound Discoverer 3.3, který využívá predikci biotransformačních reakcí a FISh scoring fragmentů. Ukázalo se postupné vymývání vybraných metabolitů v závislosti na čase (hmotovostní chyba < 1 ppm).

Přínosy a praktické využití metody

• integrované kvantifikace a profiling metabolitů v jednom LC-MS běhu,
• vysoká citlivost a selektivita pro syntetické lipidy ve složitých matricích,
• podpora preklinického vývoje LNP a optimalizace biodegradovatelných ionizovatelných lipidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na simultánní analýzu více ionizovatelných lipidů a jejich metabolitů, automatizovat přípravu vzorků pro vysokoproduktivní farmakokinetická měření a využít v kontrolách kvality a vývoji klinických formulací mRNA vakcín.

Závěr

Vyvinutá LC ddMS2-tMS2 metoda na platformě Orbitrap Exploris 480 s Vanquish UHPLC umožňuje robustní kvantifikaci a charakterizaci inkorporovaných ionizovatelných lipidů a jejich metabolitů v biologických vzorcích, čímž podporuje rychlý vývoj a hodnocení bezpečnosti nových LNP produktů.

Reference

1. Tenchov R, Bird R, Curtze AE, Zho Q. Lipid nanoparticles from liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano, 2021; DOI 10.1021/acsnano.1c04996
2. Kowalski PS, Rudra A, Miao L, Anderson DG. Delivering the messenger: advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Mol Ther Rev, 2019;27(4):710–28
3. Aldosari BN, Alfagih IM, Almurshedi AS. Lipid nanoparticles as delivery systems for RNA-based vaccines. Pharmaceutics, 2021;13:206
4. Miao L, Lin J, Huang Y, Li L, Delcassian D, Ge Y, Shi Y, Anderson DG. Synergistic lipid compositions for albumin receptor mediated delivery of mRNA to the liver. Nat Commun, 2020;11:2424
5. Maier MA et al. Biodegradable lipids enabling rapidly eliminated lipid nanoparticles for systemic delivery of RNAi therapeutics. Mol Ther, 2013;21(8):1570–78
6. Hassett KJ, Benenato KE, Jacquinet E et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Mol Ther Nucleic Acids, 2019;15:1–11
7. Kiyonami R, Tautenhahn R, Du M, Verovskaya E, Potter J. Characterization and quantification of lipid nanoparticle components and their impurities/degradants using an LC-HRAM MS platform. Thermo Fisher Sci Appl Note AN000464, 2022
8. Messengers of hope. Nat Biotechnol, 2021;39:1
9. Hassett KJ, Benenato KE et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Mol Ther Nucleic Acids, 2019;15:1–11