Quantitation of tenofovir and impurities in multi-component drug products by ternary gradient reversed-phase chromatography with charged aerosol detection

Význam tématu

Antiretrovirová kombinace emtricitabinu a tenofoviru disoproxilu je klíčová pro léčbu pacientů s HIV. Profilace nečistot v těchto multikomponentních lécích je náročná kvůli širokému spektru polarit sloučenin. Standardní UV detekce vyžaduje pro kvantifikaci každé nečistoty vlastní standard kvůli rozdílným extinkčním koeficientům. Charged Aerosol Detection (CAD) nabízí uniformní odezvu pro nevolatilní látky, což umožňuje použít jediný kalibrant pro více sloučenin. Klíčovou překážkou však zůstává závislost CAD signálu na složení mobilní fáze během gradientu, kterou lze řešit inverzním gradientem.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat:

• použití ternárního gradientu k rychlé separaci API a nečistot (adenin, tenofovir, emtricitabin) během 4,5 minuty,
• aplikaci inverzního gradientu pro kompenzaci změn složení eluční směsi před CAD detekcí a tím dosažení jednotné odezvy,
• využití single-calibrant kvantifikace pro API i neznámé nečistoty bez dostupnosti jejich standardů,
• vliv tvorby solí mezi ionizovanými anality a mobilní fází (acetát) na CAD signál a návrh jednoduché korekční strategie.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografie probíhala na UHPLC systému Vanquish Flex Duo s duálními pumpami pro analytický a inverzní gradient. Kolonou byla Thermo Scientific Accucore aQ (2,1 × 100 mm, 2,6 μm). Mobilní fáze A: voda + 0,1 % acetic acid (pH 3,5), B: methanol, C: acetonitril. Analytický gradient vedl od 0 % organiky do 85 % směsi B/C, inverzní gradient zajišťoval konstantní složení 52,5 % A / 35 % B / 12,5 % C před CAD detektorem. Detekce CAD: evaporátor 35 °C, filtr 3,6 s, sběr 20 Hz, Power Function 1,00. Pro komparativní měření byl použit UV detektor při 260 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Bez inverzního gradientu rostl CAD signál s podílem organiky, což vedlo k až 74% RSD mezi čtyřmi analyty při 30 ng. Zavedením inverzního gradientu se rozdíl snížil na 8 % RSD. Dále byla ověřena tvorba acetátových solí v pH 3,5, kdy každá molekula analyzátu asociuje jeden acetát s přídavkem ~59 Da, což vedlo k nárůstu signálu. Aplikací jednoduché korekce (poměr Mw analytu vůči Mw analytu+acetát) se RSD mezi látkami dále snížil na 7,7 %. Flow injection analýza potvrdila, že nižší molární hmotnost aditiv (formiová vs. acetic acid, TFA, HFBA) minimalizuje chybu při kvantifikaci neznámých ionizovaných sloučenin.

Přínosy a praktické využití metody

• Významné zjednodušení kvantifikace nečistot bez nutnosti vlastních standardů.
• Rychlá separace API a nečistot v rámci jednotného gradientu pod 5 minut.
• Vyrovnaná CAD odezva napříč polárními i nepolárními látkami díky inverznímu gradientu.
• Možnost prediktivní korekce signálu pro tvorbu solí s mobilní fází.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody na další multikomponentní formulace, včetně terapeutických kombinací s širším pH rozmezím. Integrace kompenzačních gradientů do autonomních CDS platform bude dál automatizovat kalibraci CAD odezvy. Další směry zahrnují zkoumání vazeb aditiv s analyty pro přesnější korekční modely a využití ternárních gradientů s odlišnými typy kolon pro optimalizaci rozlišení složitých směsí.

Závěr

Implementace invertovaného ternárního gradientu společně s CAD detekcí a korekcí tvorby solí umožňuje vysoce přesnou a rychlou jednorozpouštědlovou kvantifikaci API a jejich nečistot bez nutnosti široké řady standardů. Metoda je vhodná pro rutinní analýzy QA/QC v léčebných formulacích, kde je klíčová agilita a spolehlivost výsledků.

Reference

1. Fabel S. Ternary gradient for tenofovir disoproxil fumarate impurity profiling, Thermo Fisher Scientific Application Note 1129.
2. Iavanya B. et al. Method development and validation of combined tablet dosage form of emtricitabine and tenofovir disproxil fumarate by ultraviolet spectroscopy, Int. Research J. Pharm. 2012, 3(12), 104–108.
3. Menz M., Eggart B., Lovejoy K. et al. Charged aerosol detection — factors affecting uniform analyte response, Thermo Fisher Scientific Technical Note 72806.
4. Cohen R.D., Liu Y., Gong X. Analysis of volatile bases by HPLC with aerosol-based detection, J. Chrom. A. 2012, 1229, 172–179.