EVALUATION OF AQUEOUS-ACETONITRILE BASED MOBILE PHASE FOR UNTARGETED ANALYSIS OF POLAR METABOLOME AND LIPIDOME

Význam tématu

Komplexní analýza lipidomu a metabolomu z biologických vzorků je zásadní pro pochopení biochemických procesů v buňkách a tkáních. Odlišné chemické vlastnosti lipidů a polárních metabolitů vyžadují optimalizované chromatografické podmínky. Vývoj univerzální mobilní fáze na bázi vody a acetonitrilu zjednodušuje workflow, snižuje spotřebu rozpouštědel a zkracuje dobu analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout jednu generickou mobilní fázi na bázi vody a acetonitrilu, kterou lze použít pro nekcílovou LC-MS analýzu lipidů i polárních metabolitů z biofluidů. Autoři porovnali nově navržený ACN/water mobilní fázi se zlatým standardem na bázi isopropylalkoholu (IPA) a otestovali různé chromatografické kolonky (CSH Phenyl-Hexyl, CSH C18, CORTECS C8, BEH Amide).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy byly připraveny srážením proteinů pomocí předchlazeného IPA (ratio 1:4), centrifugovány při 10 300 g a 4 °C, supernatant ředěn IPA/ACN (50/50) a importován do UPLC vialek.

Chromatografie probíhala na systému ACQUITY Premier UPLC s těmito kolonkami:

• CSH Phenyl-Hexyl (2,1×150 mm, 1,7 µm) při 70 °C, průtok 0,6 mL/min
• CSH C18 (2,1×100 mm, 1,7 µm) při 55 °C, průtok 0,4 mL/min
• CORTECS C8 (2,1×100 mm, 2,7 µm) při 40 °C, průtok 0,6 mL/min
• BEH Amide (2,1×100 mm, 1,7 µm) pro HILIC analýzu při 40 °C, průtok 0,6 mL/min

Mobilní fáze A byla voda, fáze B acetonitril/voda (95/5) s 0,1 % kyseliny mravenčí a 1 mM formiátu amonného, gradient 70–99 % B v 6–8 min.

Detekce byla prováděna na hmotnostním spektrometru SYNAPT XS (TOF MS, ES+ a ES-).

Hlavní výsledky a diskuse

• Univerzální ACN/water mobilní fáze umožnila bezproblémové přepínání mezi lipidomy a metabolomy pouze výměnou kolonky.
• CSH Phenyl-Hexyl kolona (2,1×150 mm) zajistila kompletní eluování neutrálních lipidů (triacylglyceroly, cholesterolestery) během 10 min s výborným rozlišením.
• Hydrofobnější fáze CSH C18 a CORTECS C8 vykazovaly neúplné eluování neutrálních lipidů s ACN/water MP.
• Polární metabolity analyzované na BEH Amide koloně vykázaly srovnatelnou účinnost separace v obou ionizačních režimech.
• Žádné významné carry-over lipidů nebylo pozorováno ani při blank injekci.

Přínosy a praktické využití metody

• Jedna mobilní fáze pro lipidomiku i metabolomiku šetří čas i finanční prostředky.
• Jednodušší správa a příprava rozpouštědel v laboratoři.
• Flexibilní přechod mezi analytickými režimy bez změny solventní sady.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Adaptace metody na další biologické matrice (moč, tkáně, cerebrospinální mok).
• Automatizované platformy pro vysokopropustné zpracování vzorků.
• Vývoj cílených stacionárních fází pro specifické třídy látek.
• Integrace LC-MS dat s pokročilými algoritmy strojového učení pro hlubší biologické interpretace.

Závěr

Studie prokázala, že mobilní fáze na bázi vody a acetonitrilu s vhodnou kolonkou dokáže efektivně oddělit jak lipidy, tak polární metabolity. Nejlepší výsledky přinesla CSH Phenyl-Hexyl kolona při 70 °C. Metoda nabízí vysokou reproductibilitu, nízké carry-over a značné úspory v rutině laboratorních analýz.

Reference

1. Isaac G., Munjoma N., Gethings L.A., Mullin L., Plumb R.S. A Robust and Reproducible Reversed-Phase Lipid Profiling Method for Large Sample Sets. Waters Application Note 720006959en; červenec 2020.