Multidimensional LC for separation of protein digests – A technical description of the Agilent 1100 Series nanoflow LC/MS system

Význam tématu

Multidimenzionální kapalinová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií představuje vysoce citlivou a reprodukovatelnou metodu pro separaci a identifikaci peptidů v komplexních proteomických vzorcích. Díky kombinaci ortogonálních separačních mechanismů umožňuje efektivně analyzovat směsi o různém stupni složitosti, včetně biomarkerů z klinických vzorků a posttranslačně modifikovaných peptidů.

Cíle a přehled studie

Cílem textu je popsat konfigurace systému Agilent 1100 Series nanoflow LC MS pro on-line a off-line dvoudimenzionální chromatografii, jedno dimenzionální obohacení a validaci systému. Součástí jsou doporučené instrumentální sestavy, kontrolní metody a postupy pro analýzu reálných proteomických digesátů.

Použitá metodika a instrumentace

Systém vychází z nanoflow LC s pumpou, mikro odplynovačem, mikro zásobníkem vzorku a přepínacími ventily. Klíčové komponenty:

• SCX ionexové kolony pro první dimenzi
• C18 trap a analytické kolony pro druhou dimenzi
• Agilent LC MSD Trap XCT nebo Trap SL s ortogonálním nanospray zdrojem
• Automatizované mikro fraction collectory
• Software Spectrum Mill pro extrakci a validaci peptidových spekter
• Termostatované moduly pro uchování vzorků

Separace zahrnuje eluci peptidů se solnými plugy ze SCX kolony, koncentraci na C18 trap kolonu a následnou gradientovou RP chromatografii na nanobore kolóně.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro ověření výkonu systému byla analyzována směs bovinního sérového albuminu (BSA) o dávce 100 fmol:

• Přímá injekce: 29 jedinečných peptidů, 51 procent pokrytí sekvence
• Metoda obohacení: 20 peptidů, 39 procent pokrytí
• On-line 2D LC: 8 peptidů eludovaných plugem 150 mM NaCl, žádný průnik při 0 mM
• Stabilita nanoflow pumpy ±2 procent při 600 a 300 nL/min

Všechny režimy prokázaly vysokou citlivost, selektivitu i reprodukovatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Analýzu vzorků od jednoduchých gelových výběrů po komplexní celulární lyzáty
• Automatizaci a robustní řízení separačních parametrů
• Snížení pozadí díky ortogonálnímu nanospray
• Flexibilní volbu on-line a off-line konfigurací s různými solnými kroky

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• Integraci s vysoce rezolučními a rychlými MS analyzátory
• Optimalizaci multidimenzionálních protokolů pro kvantitativní proteomiku
• Nasazení v klinických aplikacích pro markerové studie
• Vývoj miniaturizovaných modulů pro vyšší propustnost

Závěr

Popsané konfigurace a validované postupy Agilent 1100 Series nanoflow LC MS systematizují proteomické workflow. Kontrolní metody potvrzují stabilní výkon a citlivost napříč režimy. Doporučené postupy podporují analýzu vzorků různé složitosti a jsou připraveny pro další aplikace v proteomických studiích.

Reference

• Naegle E Vollmer M Horth P Two dimensional nano liquid chromatography mass spectrometry system for applications in proteomics J Chromatogr A 2003 1009 197 205
• Vollmer M Naegle E Horth P Differential proteome analysis Two dimensional nano LC MS of E coli proteome grown on different carbon sources J Biomol Tech 2003 14 128 135
• Horth P Naegle E Vollmer M Proteome profiling of E coli Effect of heat shock conditions on protein expression LC GC 2003 16 641 647
• Agilent Application Note Two dimensional nano LC MS for complex proteomics applications 5988 9287EN 2003
• Agilent Product Brochure Agilent LC MSD Trap XCT 5988 9484EN 2003
• Agilent Product Brochure Agilent Spectrum Mill MS Proteomics Workbench 5988 9443EN 2003
• Agilent Product Brochure Agilent Nanoflow Proteomics Solution 5988 3612EN 2002
• Agilent Product Brochure Agilent Micro Fraction Collection System 5988 9614EN 2003