High-Throughput Gradient Optimization by Easily Minimizing Delay Volume

Význam tématu

Minimalizace mrtvého objemu a zkrácení doby re-ekvilibrace gradientních HPLC metod je nezbytné pro dosažení vysoké propustnosti analýz. Rychlejší doplnění kolony a rychlejší průběh gradientu zkracují celkový čas běhu, zvyšují počet vzorků zpracovatelných za jednotku času a snižují spotřebu mobile fáze.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ukázat jednoduchou modifikaci pumpy Agilent G1312B pro snížení objemu zpoždění gradientu a popsat výhody krátkých RRHT kolon s 1,8 µm částicemi. Studie porovnává chromatogramy za standardního a nízkého objemu zpoždění na sloupcích 2,1×30 mm a 4,6×30 mm a zkoumá vliv výměny stacionární fáze z C18 na C8.

Použitá metodika a instrumentace

• Agilent Rapid Resolution LC systém s G1312B binary pump SL a G1365C MWD detektorem (254 nm, micro flow cell 2 µL)
• Kolony ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18 (2,1×30 mm, 1,8 µm) a Eclipse XDB-C8 (4,6×30 mm, 1,8 µm)
• Mobilní fáze A: 0,1 % formiová kyselina ve vodě, B: 0,1 % formiová kyselina v acetonitrilu; gradient 70→100 % B/0,5 min
• Tok 1,5 mL/min (2,1 mm id) nebo 5 mL/min (4,6 mm id), teplota stacionární, detekce UV 254 nm
• Vzorek: uracil a alkylfenony C3–C14 v acetonitril/voda 50/50

Hlavní výsledky a diskuse

• Sloupce RRHT (1,8 µm) deskového objemu výrazně zkrátily re-ekvilibraci až 25× (z 7,5 min na 1,5 min u 2,1×30 mm kolony).
• Modifikací pumpy do režimu nízkého objemu zpoždění se ostré vrcholy objevily dříve a analýza se zrychlila o 14–29 %.
• Přidání 200 µL statického mixéru a firmware A.06.06 eliminuje vlnění základní linie při nízkém obsahu organiky s různou absorpcí UV složek.
• Výměnou stacionární fáze C18 za C8 se dále snížil čas záchytu a zvýšila propustnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Významné zvýšení propustnosti laboratoře díky kratší době analýzy a re-ekvilibrace.
• Snížení spotřeby mobile fáze a provozních nákladů.
• Jednoduchá přestavba pumpy bez nutnosti složitého servisu.
• Možnost rychlé optimalizace a přenosu metod mezi standardními a úzkými kolónami.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je další miniaturizace HPLC, rozšíření nabídky 1,8 µm a sub-2 µm stacionárních fází, integrace s MS detekcí a automatizované softwarové optimalizace gradientů. Vznikají také výzvy v oblasti přesnější kontroly mrtvého objemu a online monitorování složení mobile fáze.

Závěr

Úprava pumpy na nízký objem zpoždění společně s krátkými RRHT kolonami výrazně zrychluje gradientní HPLC analýzy, zlepšuje ostrost vrcholů a snižuje spotřebu solventů. Výměna stacionární fáze dále rozšiřuje možnosti optimalizace separací s minimálním úsilím.

Reference

1. Optimizing Performance of the Agilent 1200 Rapid Resolution LC System, Agilent Publication G1312-90300, March 2006, p.159.