Improved OPA /FMOC Derivatized Amino Acid Methods using Many Column Configurations for a Range of Speed and Resolution Options

Význam tématu

Online prekolonová OPA/FMOC derivatizace aminokyselin představuje zásadní nástroj pro rychlé a citlivé stanovení aminokyselin v biochemických a klinických aplikacích. Kombinace automatizované derivatizace s moderními C18 kolonkami přináší vysokou reprodukovatelnost, flexibilitu v délce analýzy i spotřebě rozpouštědel a možnost snadného převedení mezi různými chromatografickými systémy.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo aktualizovat a rozšířit zavedenou OPA/FMOC derivatizační metodu použitím deseti konfigurací ZORBAX Eclipse Plus C18 kolon a demonstrovat:

• škálovatelnost analýzy od 9 do 40 minut,
• opakovatelnost mezi injekcemi a mezi výrobními šaržemi kolon,
• lineární detekční rozsah 1–1000 pmol/µL,
• kompatibilitu se systémy Agilent 1100, 1200 a 1200 SL.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda zahrnovala automatizovanou derivatizaci ortho-ftalaldehydem (OPA) pro primární a FMOC pro sekundární aminy při pH ~10, s detekcí UV na 338 a 262 nm. Gradient eluce (% B aketonitril/methanol/voda 45:45:10) byl pro všechny kolony shodný.

Instrumentace:

• Autosamplery: Agilent G1376C WPALS a G1329A ALS
• Pumpy: Agilent G1312A/B v systémech 1100, 1200, 1200 SL
• Detekce: Diodové pole Agilent G1315B/C/D s 2 µL flow cell
• Kolony: ZORBAX Eclipse Plus C18 – 10 variant (délka 50–250 mm, ID 2.1–4.6 mm, částice 5, 3.5, 1.8 µm)
• Heat exchanger: G1316A
• Purge ventily a spojovací objímky specifické pro každou konfiguraci.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýzy vykázaly:

• vynikající reprodukovatelnost injekcí (RSD <2 % pro rané, střední i pozdní eluce),
• kompatibilitu rychlých 9minutových metod (1.8 µm, 50 mm) i robustních 40minutových (5 µm, 250 mm),
• shodné rozlišení aminokyselin napříč všemi šaržemi kolon (α hodnoty ~1.02–1.21),
• lineární kalibrační křivky s R2 ≥0.997 pro glutamát, alanin, lyzin, prolin.

Metoda prokázala snadné přenesení mezi kvaternárními a binárními pumpami i mezi systémy s různým tlakem (400 vs. 600 bar).

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaná online derivatizace a široká nabídka kolonek umožňují laboratořím:

• volit optimální poměr rychlosti a rozlišení dle vzorku,
• snížit spotřebu organických rozpouštědel a dobu equilibrace,
• dosáhnout vysoké reproducibility a dlouhodobé stability metod.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze očekávat v oblasti:

• integrovaných vysokotlakých systémů (UHPLC) a sub-2 µm částic,
• další automatizace derivatizačních kroků a zpracování dat,
• rozšíření na nové derivatizační činidla pro netradiční aminokyseliny a peptidové fragmenty.

Závěr

Aktualizovaná OPA/FMOC metoda s deseti konfiguracemi ZORBAX Eclipse Plus C18 prokázala vysokou flexibilitu, reprodukovatelnost a linearitu analýz aminokyselin. Široký výběr délek kolon a velikostí částic umožňuje optimalizaci pro nejrůznější aplikace od rychlých průtokových screeningů po detailní kvantifikace.

Reference

• Rainer Schuster a Alex Apfel, Hewlett-Packard Application Note Pub.# 5954-6257 (1986)
• Rainer Schuster, J. Chromatogr. 431, 271–284 (1988)
• Herbert Godel, Petra Seitz a Martin Verhoef, LC-GC International 5(2), 44–49 (1992)
• Angelika Gratzfeld-Huesgen, Sensitive and Reliable Amino Acid Analysis in Protein Hydrolysates using the Agilent 1100 Series HPLC, Pub.# 5968-5658EN (1999)
• John W. Henderson Jr, Robert D. Ricker, Brian A. Bidlingmeyer a Cliff Woodward, Rapid, Accurate, Sensitive and Reproducible HPLC Analysis of Amino Acids, Pub.# 5980-1193E (2000)
• Cliff Woodward, John W. Henderson Jr a Todd Wielgos, High-Speed Amino Acid Analysis (AAA) on Sub-Two Micron Reversed-phase (RP) C18 Columns, Pub.# 5989-6297EN (2007)