A More Flexible Column Thermostatting Technique in LC Method Transfer

Význam tématu

Termostatování kolony a předohřev mobilní fáze jsou zásadní pro dosažení reprodukovatelných separací v kapalinové chromatografii, zejména při vysokotlakých podmínkách UHPLC. Třecí teplo generované při průtoku mobilní fáze pod ultra vysokým tlakem může výrazně zvýšit teplotu vnitřního objemu kolony a ovlivnit retenci, selektivitu i účinnost separace. Při přenosu analytických postupů mezi různými systémy se proto kromě nastavení gradientu a objemových zpoždění musí zohlednit i princip termoregulace kolony a předohřev mobilní fáze.

Cíle a přehled studie / článku

Tento dokument se zabývá vlivem teplotního mismatche a disipace třecího tepla na chromatografické parametry. Pomocí systémů Vanquish UHPLC se porovnává dva režimy termostatování kolony (still air a forced air) s aktivním předohřevem mobilní fáze. Cílem je ukázat, jak tyto podmínky ovlivňují retenční faktory, selektivitu, účinnost separace a jak lze vhodným nastavením režimu termostatování a teplot mobilní fáze optimálně převést LC metody.

Použitá metodika a instrumentace

Studie vychází z měření retence neutrálních a polárních látek za různé rychlosti průtoku a složení eluentu. Experimenty zahrnovaly:

• Vanquish UHPLC systém s kolonním oddílem Column Compartment H podporujícím still air a forced air režim
• Aktivní předohřev mobilní fáze integrovaný ve Vanquish systému
• Dionex Chromeleon CD systém pro simultánní záznam teploty na vstupu a výstupu kolony
• Kolony Thermo Scientific Acclaim PA2 (2.1×100 mm, 2.2 μm), Acclaim RSLC C18 (3×75 mm, 3 μm) a Hypersil GOLD (2.1×100 mm, 1.9 μm)
• Isokratické i gradientní režimy s eluentem CH3CN/voda nebo CH3OH/20 mM Na2HPO4, pH 7

Hlavní výsledky a diskuse

Při still air termostatování a nedostatečném předohřevu mobilní fáze se uvnitř kolony tvoří slabý radiální teplotní gradient, průměrná teplota se blíží teplotě vstupní fáze, ale retence a selektivita se mění s rychlostí průtoku. Forced air režim umožňuje účinnou disipaci třecího tepla přes stěnu kolony, udržuje konstantní retenční faktory až do určitého průtoku, avšak vytváří výrazný radiální gradient, který při vyšších rychlostech vede k rozšíření a deformaci píků. Měření axiálního nárůstu teploty ukázala zvýšení až o 17 °C při vysokém průtoku ve still air režimu, zatímco forced air režim odváděl část tepla ven, což potvrdilo měření teplotního rozdílu mezi vstupem a výstupem kolony. Van Deemterovy křivky pro hexanofenon prokázaly až o 40 % nižší účinnost separace při forced air režimu na nejvyšší rychlosti v porovnání se still air režimem, ale still air nabízí lepší maximální účinnost při velmi rychlých analýzách.

Přínosy a praktické využití metody

Správně zvolený režim termostatování a předohřev mobilní fáze umožňuje:

• Zachování konzistentních retenčních časů a selektivity při přenosu metod mezi různými LC/UHPLC systémy
• Optimalizaci účinnosti separace pro rychlé i běžné analýzy
• Snížení deformace píků a zajištění ostrosti signálu při vysokých průtocích
• Přesnou kontrolu skutečné separační teploty uvnitř kolony

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším směrem je automatizace řízení teploty a předohřevu pomocí pokročilých řízení na bázi umělé inteligence pro dynamické přizpůsobení teplotních profilů v reálném čase. Vývoj mikro- a nano-kolon s optimalizovaným termálním managementem výrazně rozšíří použití UHPLC v biofarmaceutické analýze. Dále lze očekávat integraci pokročilých tepelných senzorů a adaptivních krytů kolony pro monitoring a kompenzaci třecího tepla.

Závěr

Skutečná separační teplota v LC kolonu je kombinací teploty kolony a teploty vstupní mobilní fáze; třecí teplo zvyšuje teplotu uvnitř kolony a může způsobit teplotní mismatch. Forced air a still air režimy termostatování nabízejí kompromis mezi stabilitou retence a maximální účinností. Aktivní předohřev mobilní fáze je nezbytný pro reprodukovatelnost přenosu metod. Vanquish Column Compartment H umožňuje flexibilně přepínat režimy a přesně reprodukovat podmínky jiných systémů pro optimální chromatografický výkon.

Reference

1. Thermo Scientific White Paper 71499. The Role of Temperature and Column Thermostatting in Liquid Chromatography. 2015.
2. Thermo Scientific Product Spotlight SP71195: Best in UHPLC Column Thermostatting to Fit All Needs. 2014.
3. Thermo Scientific Poster Note PN71314: Thermostatting in UHPLC: Forced Air Mode, Still Air Mode, and Method Transfer. Germering, Germany, 2014.
4. Dolan, J. Separation Science. HPLC Solutions #53: Temperature and Retention.