CAN THE EXTRACTED CHEMICAL INFORMATION FROM FFPE SAMPLES USING LA-REIMS IMAGING SUPPORT PATHOLOGICAL DIAGNOSIS?

Význam tématu

Archivované vzorky uložené jako formalin-fixované a parafin-embedované (FFPE) bloky představují cenný biologický materiál pro retrospektivní studie i klinickou praxi. Přestože jsou tyto vzorky běžně používány v histopatologii, fixace a parafinování výrazně redukují dostupnou chemickou informaci, což komplikuje aplikaci pokročilých hmotnostně spektrometrických metod v diagnostice.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo ověřit schopnost laserem asistované rapidní evaporační ionizace (LA-REIMS) v módu Imaging extrahovat a využít chemické signály v oblasti fosfolipidů (600–900 m/z) z FFPE sekcí karcinomu ledviny s jasnobuněčnou histologií. Studie sledovala, zda lze na základě získaných spektárních dat a multivariačních analýz podpořit rozlišení nádorové a zdravé tkáně.

Použitá instrumentace a metodika

Pro měření byl využit systém LA-REIMS s opticko-parametrickým oscilátorem (OPO) pracujícím na 2 940 nm, komerční motorický XYZ-stůl pro vzorky a aerosolem spojený s REIMS zdrojem na přístroji Xevo G2 QTof MS v negativním režimu. Výzkumný soubor tvořilo deset 10 µm FFPE sekcí humanitárně potvrzeného clear-cell renálního karcinomu.
Analytický postup zahrnoval:

• Vyhodnocení vlivu jednotlivých kroků FFPE procesu na modelovém vzorku prasečí jaterní tkáně pomocí PCA a vizualizace spekter.
• Point-by-point LA-REIMS Imaging a tvorbu chemických obrazů pomocí softwaru HDI 1.4 na čtyřech významných fosfolipidových iontech.
• Nesupervidované shlukování k-nejbližších sousedů (kNN) pro prozkoumání chemických rozdílů a kvality vzorků.
• Výstavbu modelu v nástroji AMX (Abstract Model Builder) se selekcí ROI podle patologických anotací a rozvoj klasifikátorů založených na LSVC (Linear Support Vector Classifier).
• Validaci pomocí full-group-out křížové validace s vyhodnocením klasifikační přesnosti, citlivosti a specifičnosti.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza ukázala výrazný pokles intenzity signálu po formalinové fixaci, především u iontů PE(38:4) a PE(36:2), přičemž deparafinizace mírně zvýšila signál. Tvorba HDI obrazů na základě čtyř klíčových iontů (699,5; 701,5; 723,5; 885,5 m/z) umožnila vizuální rozlišení nádorového a zdravého parenchymu s ostrými hranicemi struktur. Nesupervidované kNN shlukování potvrdilo konzistentní chemické obrazce odpovídající patologické anotaci. Supervidovaná klasifikace pomocí LSVC dosáhla u vybraných vzorků až 100% správné klasifikace, průměrná úspěšnost se pohybovala mezi 48–100 % v závislosti na kvalitě signálu, přičemž u dvou vzorků měření selhala z důvodu nízké intenzity.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje doplnit histopatologické hodnocení o molekulární vrstvu fosfolipidové mapy.
• Využití stávajících FFPE archivů bez nutnosti časově náročné přípravy vzorků.
• Rychlá ambientní analýza bez použití rozpouštědel a chromatografie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj technik zesílení signálu pro zlepšení S/N poměru u FFPE vzorků.
• Optimalizace protokolů pro formalinové fixace bez parafinování pro zachování širší metabolické informace.
• Integrace LA-REIMS Imaging do multimodálních studií spolu s genomikou a histologií.

Závěr

LA-REIMS Imaging dokáže z FFPE vzorků extrahovat fosfolipidové profily, které v mnoha případech umožňují rozlišení nádorové a nenádorové tkáně. Kvalita výsledků je však silně ovlivněna úrovní lipidového vyplavení během fixace a embedování. Budoucí optimalizace protokolů a instrumentálních postupů může posílit robustnost metody pro patologickou diagnostiku.

Reference

• waters.com/posters: Fully Automated Chemical Imaging with LA-REIMS
• waters.com/posters: DESI And/or LA-REIMS? Adjacent Automated Ambient Techniques for the Precise identification of Cancer Tissue