A Benchmarking Workflow for High-Throughput DIA Label-Free Quantification using a Novel High-Resolution Accurate Mass Platform

Význam tématu

Vysokokapacitní a přesná kvantifikace proteinů je zásadní pro pochopení biologických procesů a identifikaci biomarkerů. Metoda bez značení (label-free quantification, LFQ) umožňuje kvantifikaci velkého počtu proteinů napříč širokým dynamickým rozsahem, což je klíčové pro výzkum buněčných homogenátů, plasmy či tkání. Rychlé a citlivé hmotnostní spektrometry s minimálními vzorkovými nároky mohou zkrátit dobu analýzy a zvýšit šíři pokrytí protéomu. Astral™ MS kombinuje tři analyzátory pro dosažení vysoké přesnosti hmotnostního rozlišení při rychlosti až 200 skenů za sekundu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem práce bylo otestovat výkonnost nového Orbitrap™ Astral™ hmotnostního spektrometru pro LFQ aplikace za různých podmínek: různých koncentrací vzorku (50–500 ng), délek gradientu (8–24 minut) a parametrů akvizice (DIA režim, 2Th izolační okna). Studie využila standardní směsi tří proteomů (Escherichia coli, lidské HeLa buňky, Saccharomyces cerevisiae) ve známých poměrech k vyhodnocení přesnosti, rozlišitelnosti a dynamického rozsahu kvantifikace.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC v režimu Direct Injection i Trap & Elute, kolony µPAC Neo 50 cm (20 min gradient) nebo EASY-Spray PepMap 15 cm (8–24 min run time).
• Ionizace: Thermo Scientific EASY-Spray NG Source.
• Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Astral MS s kvadrupólem pro výběr prekurzoru, Orbitrap HRAM detektorem (240 000 rozlišení) a Astral analyzátorem pracujícím až na 200 Hz v režimu data-independent acquisition (DIA) s 2 Th okny.
• Zpracování dat: Spectronaut™ 17.4 (directDIA, Q<0,01) a Proteome Discoverer™ 3.1 s algoritmem CHIMERYS™ (1 % FDR).

Hlavní výsledky a diskuse

• Proteomický rozsah a pokrytí: z 500 ng vzorku identifikováno a kvantifikováno přes 13 000 proteinů při 1 % FDR.
• Dynamický rozsah: spolehlivá kvantifikace ve více než 5 řádech; detekce proteinů od stovek po stovky tisíc kopií na buňku.
• Přesnost a opakovatelnost: 87 % proteinů mělo koeficient variančních odchylek (CV) nižší než 20 %, 72 % proteinů CV <10 %, medián CV 4,7 %.
• Vliv vzorkové zátěže a délky gradientu: nezávislost přesnosti kvantifikace na zatížení (50–500 ng) ani na průtoku gradientu (8–24 min).
• Datové body na vrchol: průměrně 4–6 bodů na chromatografický vrchol zajišťuje robustní kvantifikaci i s úzkými DIA okny.

Přínosy a praktické využití metody

Orbitrap Astral MS nabízí výjimečný poměr rychlosti, citlivosti a dynamického rozsahu, což umožňuje:

• Rychlé proteomické experimenty s nízkými množstvími vzorku.
• Spolehlivou kvantifikaci nízkoodabundantních proteinů v klinických a biomedicínských vzorcích.
• Zkrácení doby analýzy pro vysokokapacitní screening a QA/QC v průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Budoucí vývoj se zaměří na integraci umělé inteligence pro automatizovanou analýzu komplexních datových sad, rozšíření multiplexních akvizicích protokolů a kombinaci s iontovou mobilitou. Další optimalizace mikrofluidních rozhraní a nano-LC formátů zvýší citlivost i pro jedinou buňku.

Závěr

Orbitrap Astral MS prokazuje vynikající výkon pro LFQ proteomiku v DIA režimu: vysoká přesnost, stabilita a dynamický rozsah přesahující pět řádů. Metoda je vhodná pro široké spektrum výzkumných i průmyslových aplikací, kde je klíčová rychlost, citlivost a robustní kvantifikace.

Reference

1. Ghaemmaghami S., Huh W.K., Bower K. a kol. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 2003;425:737–741. doi:10.1038/nature02046