High-Confidence Targeted Data Mining of Untargeted High-Resolution Data for Lipids

Význam tématu

Analýza lipidů je zásadní pro pochopení biologických funkcí, diagnostiku onemocnění a vývoj nových léčiv. Komplexní směsi lipidů obsahují velké množství izomerů a isobarů, což ztěžuje jednoznačnou identifikaci. Zavedení vysokorozlišovací hmotové spektrometrie (HRMS) spolu s iontovou mobilitou (IM) a databázovými přístupy výrazně zvyšuje spolehlivost lipidové anotace.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vybudovat vysoce kvalitní databázi pro cílené i necílené experimenty lipidomiky s následujícími kroky:

• Převod 763 jednotkově rozlišených MRM přechodů z TQ metodiky na přesné hmotnosti.
• Získání a export MS/MS spekter a retenčních časů (RT) na LC/Q-TOF.
• Určení kolizních průřezů (CCS) na 6560 IM Q-TOF pro další filtrace.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy podstoupily extrakci butanol:methanol (1:1) s 10 mM amonného formiátu a vnitřními standardy. Po centrifugaci bylo supernatant analyzováno na přístrojích:

• 6495C QQQ – původní MRM metoda s 763 přechody.
• 6546 LC/Q-TOF – získání přesných hmotností, MS/MS spekter a RT.
• 6560 IM Q-TOF – měření CCS hodnot.

Generování molekulárních vzorců proběhlo s pomocí LipidPioneer v1.0 a následná správa databáze se realizovala v Agilent Personal Compound Database Library (PCDL).

Hlavní výsledky a diskuse

Byla vytvořena databáze pro 763 lipidů obsahující:

• Přesné hmotnosti prekurzorů.
• MS/MS spektra a odpovídající fragmenty.
• Retenční časy pro chromatografickou identifikaci.
• CCS hodnoty s vynikající opakovatelností (%RSD <0,2 %).

Necílená analýza odhalila přibližně 600 lipidů napříč hlavními třídami (fosfatidylcholiny, ceramidy, diacylglyceroly, triacylglyceroly, sphingomyeliny apod.). Zároveň byla ověřena možnost využití databáze pro nastavení PRM metod pro cílené sledování 80 klíčových lipidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší jistota anotace lipidů díky kombinaci přesné hmotnosti, RT, MS/MS a CCS.
• Škálovatelný přístup pro komplexní biologické matrixy bez potřeby stovek standardů.
• Možnost integrace do rutinních QA/QC workflow v biomedicínských a farmaceutických laboratořích.

Použitá instrumentace

• Agilent 6495C Triple Quadrupole (QQQ)
• Agilent 6546 LC/Q-TOF
• Agilent 6560 Ion Mobility Q-TOF
• Software LipidPioneer v1.0
• Agilent Personal Compound Database Library (PCDL)

Reference

1. Huynh K. et al. A Comprehensive, Curated, High-Throughput Method for the Detailed Analysis of the Plasma Lipidome. Agilent Application Note 5994-3747EN, 2021.
2. Ulmer CZ. et al. LipidPioneer: A Comprehensive User-Generated Exact Mass Template for Lipidomics. J Am Soc Mass Spectrom. 2017;28(3):562-565.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšiřování databází o další lipidové třídy a deriváty.
• Integrace strojového učení pro automatizovanou anotaci spekter.
• Zlepšení přesnosti CCS měření a standardizace mezi laboratořemi.
• Využití v klinické lipidomice a farmakometabolomice.

Závěr

Popisovaný přístup demonstruje, že kombinace převodu MRM na HRMS, iontové mobility a cílených PRM experimentů umožňuje vytvoření robustní databáze pro spolehlivou lipidovou anotaci. Tento framework usnadňuje rutinní i pokročilé výzkumné workflow v oblasti lipidomiky.