Lipidomics Workflow Guide - Agilent 6560 Ion Mobility LC/Q-TOF

Význam tématu

Lipidomika je klíčovou oblastí metabolomiky zabývající se komplexní analýzou lipidů v biologických vzorcích. Díky přidání iontově-mobilitní spektrometrie (IM-MS) získáváme další dimenzi separace izomerických lipidů na základě kolizní příčné plochy (CCS). To významně zvyšuje spolehlivost identifikace lipidů nejen podle hmotnosti a retenční doby, ale také podle tvaru a velikosti molekul.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem tohoto návodu je předvést primární pracovní postup lipidomiky za pomoci analytické sestavy Agilent 6560 Ion Mobility LC/Q-TOF a balíku softwaru MassHunter. Postup kombinuje akvizici dat v režimech All Ions a MS1, následné kalibrace, vytvoření vlastního databázového souboru (PCDL) pro lipidy a extrakci a identifikaci funkcí. Výsledky se následně statisticky vyhodnocují v Mass Profiler Professional.

Použitá metodika a instrumentace

• Agilent 6560 Ion Mobility LC/Q-TOF s kapalinovou chromatografií (LC) a iontově-mobilitním oddělením (IM) pro zpřesnění separace lipidických izomerů.
• All Ions fragmentace pro záznam fragmentů pro tvorbu lipidových signatur.
• Jednopólová CCS kalibrace (beta a TFix konstanty) vypočtená v IM-MS Browseru a aplikovaná na všechny datové soubory.
• IM-MS Reprocessor pro korekci hmotnostní kalibrace interními standardy.
• Lipid Annotator pro generování personalizované lipidové databáze (PCDL) na základě přesné hmotnosti, retenční doby a CCS.
• Mass Profiler pro detekci a zarovnání funkcí (features) v MS1 datech.
• ID Browser pro přiřazení funkcí k lipidem z PCDL a export výsledků do CEF souborů.
• Mass Profiler Professional (MPP) pro tvorbu lipidové matice, vizualizace distribuce lipidických tříd a statistické nástroje.

Hlavní výsledky a diskuse

• Úspěšně byla vytvořena databáze PCDL obsahující několik desítek identifikovaných lipidů s referencí na jejich sumární složení a fragmenty.
• V MS1 datech bylo automaticky nalezeno a zarovnáno množství funkcí odpovídajících lipidickým molekulám.
• ID Browser prokázal vysokou konfidenčnost identifikací díky využití trojrozměrných kritérií (m/z, RT, CCS).
• V MPP byla sestavena lipidová matice demonstrující nárůst intenzity referenčních lipidů podle přidané koncentrace standardů.
• Graf CCS vs. m/z jasně odlišil třídy lipidů podle velikosti a tvaru molekul.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení specifity identifikace lipidů díky integraci CCS informací.
• Jednoduchá tvorba vlastní lipidové knihovny pro rychlou rutinní analýzu.
• Široké využití v biomedicínském výzkumu, farmaceutické syntéze, environmentálních studiích a potravinářské chemii.
• Podpora objevování biomarkerů a integrace multi-omics dat pro komplexní chápání biologických systémů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Nasazení multiplexovaných režimů akvizice dat a předzpracování v PNNL Preprocessor pro maximální citlivost.
• Rozšíření databází o nové lipidové standardy a umělou inteligenci pro autonomní identifikaci.
• Propojení s dalšími „omics“ platformami a pokročilými statistickými a strojově-učícími nástroji v MPP.
• Validace workflow v klinických a průmyslových laboratořích pro standardizované aplikace QA/QC.

Závěr

Popisovaný postup představuje komplexní a reprodukovatelný rámec pro LC/IM-MS lipidomiku, který spojuje kalibrace, automatizované anotace, multikriteriální identifikaci a pokročilou vizualizaci dat. Tento protokol usnadňuje odhalování lipidových biologických markerů a podporuje rutinní i výzkumné aplikace.

Reference

• Agilent 6560 Ion Mobility LC/Q-TOF Fundamentals Guide
• Agilent MassHunter Lipid Annotator Application Guide
• Agilent MassProfiler Professional Software User Manual
• www.lipidmaps.org
• PNNL PreProcessor Documentation