Acarbose impurity analysis: method migration from UV detection to universal charged aerosol detection

Význam tématu

Acarbose je alfa-glukosidázový inhibitor využívaný v léčbě diabetu 2. typu. Jeho komplexní struktura a absence silného chromoforu komplikují stanovení nečistot standardní UV detekcí. Charged Aerosol Detection (CAD) představuje univerzální a citlivou metodu pro detekci nevolatilních látek bez chromoforu a umožňuje rozšířit spektrum identifikovaných a kvantifikovaných nečistot.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit vhodnost HPLC-CAD metod jako alternativy či doplňku k UV detekci podle monografie Ph. Eur. 2089 pro analýzu nečistot acarbose. Pro tento účel byly vyvinuty a porovnány dvě metody: Amide-HILIC a Hypercarb, které využívají volatility mobilních fází a stabilnější stacionární fáze.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex UHPLC system (Base Horizon/Flex, Dual Pump F, Split Sampler FT, Column Compartment H)
• Vanquish Charged Aerosol Detector H
• Thermo Scientific Corona Nitrogen 1010 nitrogen generator
• Chromeleon CDS ver. 7.3.0

Použitá metodika

Testní a referenční roztoky byly připraveny dle Ph. Eur. monografie: 200 mg acarbose v 10 mL vody; CRS obsahovalo nečistoty A–G. Amide-HILIC metoda využívala kolonu Accucore 150 Amide HILIC (100×2,1 mm, 2,6 µm), fáze A: 50 mM acetátový pufr pH 5,8, fáze B: acetonitril; gradient s jemnými změnami %B; průtok 0,6 mL/min; teplota 45 °C; injekce 2,5 µL; CAD: odpařovací teplota 50 °C; datová rychlost 10 Hz. Hypercarb metoda používala kolonu Hypercarb (150×4,6 mm, 3 µm), fáze A: voda/0,1 % TFA, fáze B: acetonitril/0,1 % TFA; gradient 8→13→8 % B; průtok 1,0 mL/min; teplota 90 °C; injekce 2,5 µL; CAD nastavení obdobné.

Hlavní výsledky a diskuse

Amide-HILIC metoda prokázala spolehlivou separaci acarbose a nečistot s LOQ 0,20 % a validací dle ICH Q2(R1) (specifičnost, opakovatelnost, linearita). Hypercarb metoda umožnila rozlišení epimerů při zvýšené teplotě a kyselém pH s LOQ 0,10 %. Obě metody detekovaly dodatečné piky maltózy a maltotriózy, které UV detekce nedokáže zobrazit. Použití stabilnějších kolonn na bázi amidu či grafitického uhlíku odstranilo problémy se slábnutím APS fází a paměťovými efekty.

Přínosy a praktické využití metody

• Univerzální detekce nevolatilních nečistot bez chromoforu
• Eliminace korekčních faktorů díky ekvivalentnímu signálu CAD
• Kompatibilita s LC-MS chemikáliemi a mobilními fázemi
• Větší stabilita stacionárních fází a reprodukovatelnost analýzy

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace CAD s hmotnostní spektrometrií pro strukturuální identifikaci, vývoj nových stacionárních fází odolných vůči extrémním podmínkám, automatizace přípravy vzorků a pokročilá softwarová analýza dat povedou k dalšímu zkrácení doby a zvýšení efektivity analýzy komplexních sacharidů a dalších makromolekul.

Závěr

Migrace metody stanovení nečistot acarbose z UV na CAD byla úspěšná. Obě vyvinuté metody (Amide-HILIC i Hypercarb) splňují požadavky Ph. Eur., poskytují stabilní signál a širší spektrum detekčních možností. Doporučuje se využívat LC-MS grade chemikálie a optimalizovat reekvilibraci gradientu pro maximální reprodukovatelnost.

Reference

1. Drugs.com: Acarbose monograph.
2. Steinhilber D, Schubert-Zsilavecz M, Roth HJ. Medizinische Chemie, 2. vydání, 2010.
3. Wehmeier UF, Piepersberg W. Biotechnology and molecular biology of the alpha-glucosidase inhibitor acarbose. Appl Microbiol Biotechnol. 2004;63:613–625.
4. European Pharmacopoeia 11.0, Monograph 2089, 2023.
5. Menz M et al. Technical Note: Charged aerosol detection – factors affecting uniform response. 2021.
6. Leistner A, Holzgrabe U. Alternative methods to assess the impurity profile of a monographed API using acarbose as an example. J Pharm Biomed Anal. 2022;221:115063.
7. Muellner T et al. Technical Guide: Factors influencing CAD performance. 2021.
8. Fu X et al. Separation of carbohydrate isomers and anomers on tetrazole-bonded phase by HILIC. J Chromatogr A. 2020;1620:460981.
9. Porsch B, Kratka J. Chromatographic stability of silica-based aminopropyl phases. J Chromatogr A. 1991;543:1–7.
10. ICH Q2(R1) Validation of analytical procedures: text and methodology. 2005.
11. Koizumi K. HPLC separation of carbohydrates on graphitized carbon columns. J Chromatogr A. 1996;720:119–126.
12. Pereira L. Porous graphitic carbon as HPLC stationary phase: theory and applications. J Liq Chromatogr Relat Technol. 2008;31:1687–1731.