Determination of Galactosamine-Containing Organic Impurities in Heparin by HPAE-PAD

Význam tématu

Heparin je běžně používané léčivo s antikoagulačním účinkem. V roce 2008 byla odhalena kontaminace oversulfated chondroitin sulfátem, která vyvolala závažné nežádoucí reakce a úmrtí pacientů. Přesné stanovení obsahu galaktosaminu jako signatury kontaminujících chondroitin sulfátů je klíčové pro zajištění bezpečnosti léčiv a pro splnění požadavků revidované monografie USP pro heparin.

Cíle a přehled studie

Studie implementuje metodu HPAE-PAD (vysokoúčinná aniontovýměnná chromatografie s pulzní amperometrickou detekcí) v souladu s navrhovanou revizí monografie USP pro stanovení organických nečistot v heparinu. Cílem bylo:

• Optimalizovat separaci galaktosaminu a glukosaminu po kyselém rozkladu heparinu.
• Porovnat automatickou eluentní generaci (EG) s manuálně připravenými hydroxidovými eluity (KOH, NaOH).
• Ověřit opakovatelnost, přesnost a robustnost metody včetně různého složení kolon a typů elučních systémů.

Použitá metodika

Vzorek heparinu byl hydrolyzován v 5 N HCl při 100 °C po dobu 6 hodin, což uvolnilo glukosamin a galaktosamin. Po ochlazení a naředění byly analyty separovány na Dionex CarboPac PA20 analytické kolóně doplněné AminoTrap kolónou. Eluenty na bázi KOH (14–100 mM) byly generovány online nebo připraveny manuálně. Detekce probíhala pulzní amperometrií na zlatém elektrodovém čipu.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Dionex ICS-3000 RFIC-EG systém (SP/DP pumpa, EG modul, CR-ATC kationtový filtr, ED detektor)
• Dionex CarboPac PA20 analytická kolóna (3 × 150 mm) a Dionex AminoTrap kolóna (3 × 30 mm)
• EGC II KOH cartridge, CR-CTC kationtová kolóna
• Elektrochemická bunka s jednorázovou zlatou pracovnou elektrodou; Chromeleon 6.8 pro řízení a zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje vysokého rozlišení (USP NLT 2; experimentálně >3,2) a účinnosti kolóny okolo 5 000–6 000 N. Asymetrie píků se pohybuje kolem 1,1–1,2. Limit detekce galaktosaminu v digestech heparinu je přibližně 0,04 % (w/w). Intradenní RSD pro měření <10 %, mezidenní RSD <1 % u standardu, 4,3 % u vzorku se 1% přídavkem dermatan sulfátu. Porovnání online EG a manuální přípravy KOH/NaOH prekurzorů ukázalo vyrovnané výsledky, což potvrzuje robustnost metody. Výsledky byly konzistentní na dvou různých kolónách a s různou kombinací strážných kolón.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rutinní kontrolu kvality heparinových šarží v souladu s USP monografií. Díky eluentní generaci je minimalizována variabilita přípravy elučních pufrů a zrychluje se workflow v kvalitativních a kvantitativních laboratořích. Možnost použití manuálních eluentů poskytuje alternativu pro laboratoře bez EG systému.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s vysoko­průtokovými automatickými přípravami vzorků pro klinické a farmaceutické laboratoře.
• Rozšíření na další glykozaminoglykany a varianty kontaminantů.
• Propojení s hmotnostní spektrometrií pro strukturální identifikaci neznámých nečistot.
• Vývoj nových sorpčních materiálů pro zlepšení stability a životnosti strážných kolón.

Závěr

Vyvinutá HPAE-PAD metoda splňuje požadavky revidované USP monografie pro stanovení organických nečistot v heparinu. Dosahuje vysoké citlivosti, opakovatelnosti i robustnosti jak při eluentní generaci, tak při manuální přípravě elučních pufrů. Umožňuje spolehlivou detekci kontaminujících chondroitin sulfátů v heparinových vzorcích.

Reference

• World Health Organization Alert No.118, 2008. Contaminant Detected in Heparin Material.
• FDA Public Health Update, 2008. Recall of Heparin Sodium Injection and Heparin Lock Flush Solution.
• Guerrini M. et al. Oversulfated Chondroitin Sulfate Is a Contaminant in Heparin Associated with Adverse Clinical Events. Nature Biotechnology 2008, 26, 669–675.
• Heparin Sodium, Pharmacopeial Forum 2009, 35(1), 1–10.
• Dionex Application Note 235, LPN 2306, 2009.
• Dionex Technical Note 21, LPN 034889-03, 1998.
• Dionex Technical Note 71, LPN 1932-01, 2007.