Streamlining characterization and monitoring of oligonucleotide impurities using an Orbitrap-based LC-HRAM-MS platform

Význam tématu

Charakterizace a kvantifikace nečistot v terapeutických oligonukleotidech je nezbytná pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti léků. Vzhledem ke složitým chemickým modifikacím a podobnosti produktů a nečistot poskytuje vysokorozlišující LC-HRAM-MS platforma spolehlivý nástroj pro detailní analýzu sekvence, modifikací a poměrové kvantifikace bez nutnosti kompletní chromatografické separace.

Cíle a přehled studie

Prostudovat a demonstrovat:

• Využití BioPharma Finder 5.1 pro zpracování ddMS2 dat z Orbitrap Exploris™ 240 k detailní sekvenační charakterizaci a lokalizaci modifikací.
• Použití Chromeleon™ CDS 7.3.1 pro relativní kvantifikaci plnohodnotného produktu (FLP) a nečistot na základě full MS a UV dat.
• Přímý přenos metody mezi Orbitrap Exploris™ 240 a Exploris™ MX detektory prostřednictvím eWorkflow postupu.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografie: Reversed-phase IPRP-LC na DNAPac™ RP kolóně (2,1 × 250 mm, 4 µm) s mobilními fázemi A (H2O + 30 mM TEA, 100 mM HFIP) a B (50 % MeOH + 30 mM TEA, 100 mM HFIP). Gradient 5–90 % B za 45 minut, průtok 0,3 mL/min.

MS detekce: Orbitrap Exploris 240 pro ddMS2 (stepped NCE 17, 20, 23; rozlišení 30 000), full MS rozlišení 120 000, m/z 420–1 600. Orbitrap Exploris MX pro full MS s identickými parametry zdroje.

Použitá instrumentace:

• Vanquish™ Horizon a Flex UHPLC systémy
• Orbitrap Exploris™ 240 a Exploris™ MX HRAM detektory
• BioPharma Finder™ 5.1 software
• Chromeleon™ CDS 7.3.1 se speciálním eWorkflow postupem

Hlavní výsledky a diskuse

Podle ddMS2 dat bylo možné dosáhnout 100 % pokrytí primární sekvence a lokalizovat modifikace (2’F, 2’MOE, deoxyribóza, biotin-TEG). Identifikovány byly různé typy nečistot: zkrácení z 5’ konce (n-x), oxidace, deaminace, ztráta bází. Pro každou nečistotu byly detekovány až desítky nabitých stavů s delta ppm < 4 ppm, skóre jistoty ≥ 99 % a ASR ≈ 1,0.

Pro relativní kvantifikaci byly porovnány UV a full MS přístupy. I při částečně překrývajících se píkoch byly výsledky v obou režimech srovnatelné (rozdíl < 0,5 % u hlavních nečistot). V rámci tří nastavení (Orbitrap Exploris 240 + Horizon, Exploris MX #1 + Horizon, Exploris MX #2 + Flex) byla přístrojová variabilita < 10 % RSD.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní, základ po základu potvrzení sekvence a lokalizace modifikací.
• Spolehlivá detekce i nízkoodstupňových nečistot (pod 1 %).
• Porovnatelné výsledky kvantifikace pomocí LC-UV a LC-HRAM-MS.
• Rychlý přenos metody mezi různými přístroji bez manuálních úprav díky eWorkflow.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na delší a více modifikované oligonukleotidy, automatizace analýz a integrace s AI pro rychlejší zpracování a výstražné systémy během QA/QC. Vzrůstající regulace podpoří standardizaci HRAM-MS metod v průmyslu.

Závěr

Orbitrap-based LC-HRAM-MS platforma s BioPharma Finder a Chromeleon eWorkflow poskytuje robustní a univerzální řešení pro detailní charakterizaci, lokalizaci modifikací a kvantifikaci nečistot terapeutických oligonukleotidů s vysokou citlivostí a reprodukovatelností.

Reference

1. Igarashi J. et al. Research and development of oligonucleotide therapeutics in Japan for rare diseases. Future Rare Diseases 2022, 2(1). https://doi.org/10.2217/frd-2021-0008
2. Bennett C.F. Therapeutic antisense oligonucleotides are coming of age. Annu. Rev. Med. 2019, 70, 307–321. https://doi.org/10.1146/annurev-med-041217-010829
3. Sutton J.M. et al. Current state of oligonucleotide characterization using liquid chromatography-mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2020, 31, 1775.
4. Pourshahian S. Therapeutic Oligonucleotides: impurities, degradants, and their characterization by mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 2019.
5. Fountain K.J.; Gilar M.; Gebler J.C. Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by LC-ESI-MS. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 646–653.
6. Basiri B. et al. Role of fluorinated alcohols as mobile phase modifiers for LC-MS analysis of oligonucleotides. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2017, 28(1), 190–199.
7. Rentel C. et al. Assay, purity, and impurity profile of phosphorothioate oligonucleotide therapeutics by IP-HPLC-MS. Nucleic Acid Therapeutics 2022, 32(3), 206–220.
8. Rentel C. et al. Determination of oligonucleotide deamination by high-resolution mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 2019, 173, 56–61.
9. Thermo Fisher Scientific Application Note 21476: Separation of mixed-base oligonucleotides using high-resolution reversed-phase column.
10. Thermo Fisher Scientific Application Brief 74058: Characterization of synthetic double-stranded siRNA using HRAM-MS.
11. Thermo Fisher Scientific Application Brief 73789: Oligonucleotide mapping using BioPharma Finder software.
12. Thermo Fisher Scientific Application Note 000463: The MAM 2.0 workflow enables seamless transition from R&D to QC.