UHPLC Analysis of 2-Aminobenzamide- Labeled Glycans with the Vanquish Flex System

Význam tématu

Glykanová analýza je kritická pro pochopení struktury a funkce bioterapeutik, zejména rekombinantních proteinů a monoklonálních protilátek. Variace v glykozylaci ovlivňují bioaktivitu, stabilitu a immunogenicitu léčiv. Navíc se glykované struktury stávají důležitými biomarkery v diagnostice onemocnění.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje separaci a detekci 2-aminobenzamid (2-AB) značených N-glykanů pomocí UHPLC systému Vanquish Flex s fluorescenčním detektorem. Hlavními cíli jsou:

• Ukázat rozlišení komplexních glykanových knihoven (bovinní fetuin, IgG).
• Zhodnotit precizi retenčních časů a ploch špiček.
• Analyzovat linearitu detekce pro různé glykanové standardy.
• Poskytnout doporučení pro volbu průtokové buňky detektoru.

Použitá metodika a instrumentace

Soustava Vanquish Flex UHPLC vybavená Fluorescence Detector F s možností volby 2 µL nebo 8 µL buňky. V separaci se uplatnily dvě kolony:

• GlycanPac AXR-1 (2,1 × 250 mm, 1,9 µm) s ternárním gradientem ACN/woda/ammonium formát (100 mM, pH 4,4).
• Accucore 150-Amide-HILIC (2,1 × 150 mm, 2,6 µm) s binárním gradientem ACN/ammonium formát (50 mM, pH 4,4).

Detekce probíhá při excitaci 320 nm a emisi 420 nm (nebo alternativně 250/430 nm), citlivost nastavena na 7–8, sběr dat 5–10 Hz. Pufry se připravují z ammonium formiátu s pH upraveným na 4,4 formiovou kyselinou. Vzorky glykanů se značí 2-AB, standardy zahrnují NA2, A1, A2 a komplexní knihovny fetuinu a IgG.

Hlavní výsledky a diskuse

Separace 2-AB-N-glykanů z bovinního fetuinu vykázala přes 60 špiček do 50 min s precizí retenčních časů RSD ≤ 0,1 %. Rozlišení IgG glykanů na HILIC kolóně poskytlo více než 20 špiček do 30 min s RSD ≤ 0,04 %. Jednotlivý standard 2-AB-NA2 dosáhl RSD retenční doby 0,008 %. Lineární oblast detekce pro 2-AB-NA2, A1 a A2 pokrývala rozsahy 0,05–10 pmol s koeficientem r² > 0,99. Porovnání 2 µL vs. 8 µL buňky ukázalo, že menší buňka zvyšuje rozlišení, zatímco větší buňka zajišťuje vyšší výšky špiček a citlivost.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká precize retenčních časů umožňuje spolehlivou identifikaci pomocí databází.
• Široká linearita a nízké detekční limity podporují kvantifikaci v rozsahu femto- až pikomolů.
• Biokompatibilita systému umožňuje přímé napojení na hmotnostní spektrometr pro další charakterizaci.
• Flexibilita volby průtokové buňky přizpůsobí analýzu požadavkům na rozlišení či citlivost.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zmenšování průtokových buněk a optimalizace extra-column dead volume pro zlepšení rozlišení.
• Integrace UHPLC-FLD s MS/MS pro komplexní glykomickou charakterizaci ve vysoké propustnosti.
• Automatizované workflow pro značení a čištění glykanů s cílem zkrátit dobu přípravy vzorků.
• Využití pokročilých datových nástrojů a AI k rychlé interpretaci glykanových profilů jako biologických markerů.

Závěr

Systém Vanquish Flex UHPLC s fluorescenční detekcí poskytuje robustní, citlivou a vysoce přesnou platformu pro analýzu 2-AB značených glykanů. Výsledky potvrzují vynikající retenční stabilitu, linearitu a flexibilitu metody, což přispívá k rozvoji biopharma glykomiky a QA/QC procesů.

Reference

1. Bertozzi C.R.; Freeze H.H.; Varki A.; Esko J.D. Glycans in Biotechnology and the Pharmaceutical Industry, Essentials of Glycobiology, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009.
2. Kobata A.; Amano J. Altered glycosylation of proteins produced by malignant cells, Immunol. Cell Biol. 2005, 83, 429–439.
3. Dube D.H.; Bertozzi C.R. Glycans in cancer and inflammation—potential for therapeutics and diagnostics, Nat Rev Drug Discov. 2005, 4, 477–488.
4. Arnold J.N. et al. Novel Glycan Biomarkers for the Detection of Lung Cancer, J. Proteom. Res. 2011, 10(4), 1755–1764.
5. Thermo Scientific PN 70513: Novel Glycan Column Technology for LC-MS Analysis of Labeled and Native N Glycans Released from Proteins and Antibodies.
6. Thermo Scientific TN 147: UHPLC Analysis of 2-AB-labeled Dextran Ladder and Assignment of Glucose Units to Unknown Glycans.
7. Domann P.J. et al. Separation-based glycoprofiling approaches using fluorescent labels, Practical Proteomics 2007, 1, 70–76.