UHPLC Analysis of 2-Aminobenzamide- Labeled Glycans with the Vanquish Flex System

Význam tématu

Glykanová analýza hraje klíčovou roli v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu, protože struktura a heterogenita glykosylace ovlivňuje bioaktivitu terapeutických proteinů, jako jsou monoklonální protilátky a rekombinantní proteiny. Fluorescenční značení 2-aminobenzamidem (2-AB) umožňuje citlivou detekci glykánů po jejich uvolnění z glykoproteinů a separaci pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie (UHPLC).

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat separaci a detekci komplexních 2-AB značených glykánových knihoven (fetuin a IgG) na systému Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC s Vanquish Fluorescence Detector F. Hodnocena byla presnost retenčního času, plošná presnost a linearita signálu pro tři standardní glykany a doporučení k volbě vhodné velikosti detekční buňky.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex UHPLC system – System Base, Quarternary Pump F, Split Sampler FT (25 µL loop), Column Compartment H s aktivním předehřívačem
• Vanquish Fluorescence Detector F s volitelnou 2 µL a 8 µL flow cell
• Kolony: Thermo Scientific GlycanPac AXR-1 (2.1 × 250 mm, 1.9 µm) a Accucore 150 Amide-HILIC (2.1 × 150 mm, 2.6 µm)
• Software: Dionex Chromeleon CDS v7.2 SR3

Použitá metodika

Pro přípravu mobilních fází se připravily roztoky acetonitrilu, vody a amonného formiátu (50 a 100 mM, pH 4.4). Byly definovány dva gradientní programy pro uvedené kolony. Detekce proběhla při excitaci 250 nebo 320 nm a emisi 430 nebo 420 nm s citlivostí 7–8 a lamp mode HighPower. Vyhodnocena byla přesnost opakovaných injekcí a linearita signálu v rozsahu femto- až picomolů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Separační výkon: U fetuinových glykánů bylo detekováno přes 60 piků v průběhu 50 minut, u IgG glykánů více než 20 piků během 30 minut.
• Presnost retenčního času: RSD ≤ 0.1 % (fetuin), ≤ 0.04 % (IgG) a 0.008 % (2-AB-NA2 standard, n=6).
• Plošná presnost: RSD ≈ 0.92 % pro 1 pmol 2-AB-NA2 (n=5).
• Linearita: Koeficient determinace r2 ≥ 0.997 pro standardy 2-AB-NA2, 2-AB-A1 a 2-AB-A2 v obou flow cells.
• Volba flow cell: 8 µL cell poskytuje vyšší signál s mírně širšími piky vhodnými pro velmi nízké koncentrace; 2 µL cell zajišťuje vyšší rozlišení píků.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou opakovatelnost retenčních časů, široký lineární rozsah a flexibilitu při volbě detekční buňky. Uplatní se při kvalitativní a kvantitativní analýze glykosylace v prostředí QA/QC biotechnologických a farmaceutických laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metodiky o automatizaci přípravy vzorků, integraci s hmotnostní spektrometrií (UHPLC-MS/MS), vyvíjení nových fluorescenčních značení a rychlejších gradientních protokolů pro vyšší propustnost a detailnější glykanovou charakterizaci.

Závěr

Systém Vanquish Flex UHPLC ve spojení s Vanquish Fluorescence Detector F prokázal vynikající výkon při analýze 2-AB značených glykánů, s vysokou presností, linearitou a možností volby optimální detekční buňky dle aplikačních potřeb.

Reference

1. Bertozzi CR, Freeze HH, Varki A, Esko JD. Glycans in Biotechnology and the Pharmaceutical Industry. In: Essentials of Glycobiology. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009:Chapter 51.
2. Kobata A, Amano J. Altered glycosylation of proteins produced by malignant cells, and application for the diagnosis and immunotherapy of tumours. Immunol Cell Biol. 2005;83:429–439.
3. Dube DH, Bertozzi CR. Glycans in cancer and inflammation—potential for therapeutics and diagnostics. Nat Rev Drug Discov. 2005;4:477–488.
4. Arnold JN, Saldova R, Galligan MC, Murphy TB, Mimura-Kimura Y, Telford JE, Godwin AK, Rudd PM. Novel Glycan Biomarkers for the Detection of Lung Cancer. J Proteome Res. 2011;10(4):1755–1764.
5. Thermo Fisher Scientific. Novel Glycan Column Technology for the LC-MS Analysis of Labeled and Native N Glycans Released from Proteins and Antibodies. PN 70513.
6. Thermo Fisher Scientific. UHPLC Analysis of 2-AB-labeled Dextran Ladder and Assignment of Glucose Units to Unknown Glycans. TN 147.
7. Domann PJ, Pardos-Pardos AC, Fernandes D, Spencer DIR, Radcliffe CM, Royle JP, Dwek RA, Rudd PM. Separation-based glycoprofiling approaches using fluorescent labels. Practical Proteomics. 2007;1:70–76.