Determination of Tobramycin and Impurities Using HPAE-PAD

Význam tématu

Tobramycin patří mezi aminoglykosidová antibiotika široce používaná v oftalmických i intravenózních aplikacích. Přítomnost nečistot jako kanamycin B, nebramine a neamine je třeba přísně kontrolovat, aby byla zaručena bezpečnost a účinnost léčiva.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout vysoce reprodukovatelnou a citlivou metodu pro stanovení tobramycinu a jeho hlavních nečistot pomocí vysokovýkonné aniontové výměnné chromatografie s pulzní amperometrickou detekcí (HPAE-PAD). Klíčovým prvkem je automatická výroba hydroxidového elučního pufru a použití jednorázových zlatých elektrod.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografický systém Dionex BioLC s eluentním generátorem EG50 pro přípravu KOH elučního pufru (2 mM) bez karbonátových kontaminantů.
• Kolonová sestava CarboPac PA1 analytická a ochranná kolona s CR-ATC aniontovou pastí po generátoru elučního pufru.
• Pulsní amperometrický detektor ED50 s jednorázovými zlatými pracovními elektrodami (Carbohydrate nebo AAA-Direct waveform).
• Přístroje: gradientní/isosrtatický pumpovací systém, vakuový degasér, autosampler AS50 a Chromeleon software pro řízení a sběr dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Separace tobramycinu a pěti nečistot byla dosažena za 15 minut s rozlišením >5,0 (farmakopejní požadavek >3,0).
• Lineární rozsah detekce přes 3 řády velikosti: až 35 µM (karbo waveform) a 38 µM (AAA-Direct waveform).
• Detekční limity (LOD) v rozsahu 0,03–0,11 µM (karbo) a 0,01–0,02 µM (AAA-Direct).
• Vysoká přesnost a reprodukovatelnost: retence 0,2–0,4 % RSD, plocha píků 1,1–4,0 % RSD.
• Robustnost: malé odchylky eluentní koncentrace nebo průtoku a výměna elektrod či kolon neovlivnily signifikantně výsledky.
• Automatická výroba a čištění elučního pufru minimalizuje variabilitu a riziko adsorpce CO₂.

Přínosy a praktické využití metody

• Zaručená stabilita a reprodukovatelnost měření pro kontrolu kvality tobramycinu.
• Eliminace chyb při manuální přípravě elučního pufru a oxidačních přídavků.
• Jednorázové galvanicky vyrobené elektrody zajišťují konzistentní detekční citlivost a pohodlnou údržbu.
• Metoda je vhodná pro rutinní QA/QC laboratoře farmaceutické výroby.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky na další aminoglykosidová antibiotika a jejich degradanty.
• Integrace modulů pro on-line monitorování fermentačních procesů.
• Další miniaturizace a automatizace přípravy vzorků a elučního systému.
• Využití v regulovaných prostředích s vysokými nároky na validaci analytických metod.

Závěr

HPAE-PAD s eluentním generátorem a jednorázovými zlatými elektrodami poskytuje robustní, citlivou a reprodukovatelnou metodu pro stanovení tobramycinu a jeho nečistot. Metoda splňuje požadavky farmakopejí i průmyslové praxe a usnadňuje rutinní kontrolu kvality.

Reference

1. Barnhart ER. Physicians’ Desk Reference. 44th ed. Oradell, NJ: Medical Economics; 1990.
2. European Pharmacopoeia. 5th ed. Strasbourg: Council of Europe; 2004.
3. Szunyog J, Adams E, Roets E, Hoogmartens J. J Pharm Biomed Anal. 2000;23:891–896.
4. Polta JA, Johnson DC, Merkel KE. J Chromatogr. 1985;324:407–414.
5. Dionex Corp. Application Note 61. LPN #034289. Sunnyvale, CA; 1989.
6. Statler JA. J Chromatogr. 1990;92:244–246.
7. Cheng J, Jandik P, Avdalovic N. Anal Chem. 2003;75:572–579.
8. Cheng J, Jandik P, Avdalovic N. J Chromatogr A. 2003;997:73–78.
9. ICH Q2A. Validation of Analytical Procedures. 1994.
10. ICH Q2B. Validation of Analytical Procedures: Methodology. 1996.
11. FDA. Guidance for Industry: Analytical Procedures and Method Validation. 2000.
12. FDA. Reviewer Guidance. Validation of Chromatographic Methods. 1994.
13. FDA. Submitting Samples and Analytical Data for Methods Validation. 1987.
14. FDA & CVM. Bioanalytical Method Validation. 2001.
15. USP <1225>. Validation of Compendial Methods. USP 27, NF 22; 2004.
16. USP <621>. Chromatography. USP 27, NF 22; 2004.
17. Dionex. Technical Note 21: Optimal Settings for PAD.
18. Dionex. AAA-Direct Amino Acid Analysis System Manual.