SMART Digest Kit User Manual

Význam tématu

SMART Digest Kit představuje pokročilou enzymatickou metodu pro rychlou, jednoduchou a vysoce reprodukovatelnou digesci proteinů, klíčovou pro biofarmaceutické a proteomické aplikace. Díky využití optimalizovaných termostabilních enzymů se výrazně zkracuje doba přípravy vzorků a zvyšuje se konzistence výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Uživatelská příručka popisuje konstrukci SMART Digest Kitů v různých formátech (trypsin, chymotrypsin, proteináza K; řešení nemagnetická, magnetická a rozpustná), jejich skladování a praktický postup digesce a následného čištění vzorků. Cílem je umožnit jednoduchou implementaci v laboratorních workflows od vývoje až po rutinní QC.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnuje:

• Přípravu směsi: 150 µl pufru, 50 µl vzorku, 15 µl enzymové pryskyřice (nebo 5 µl rozpustné trypsinové formy).
• Digesci při 70 °C a 1 400 RPM (inkubace 5–240 minut dle optimalizace).
• Optimalizaci času digesce: sledování úbytku intact proteinu a nárůstu peptidových špiček.
• Čištění vzorku: odstředění, vakuová filtrace nebo SOLAµ SPE podle složitosti matice.

Instrumentace:

• Termostatovaný shaker s heated block a heated lid.
• Magnetický stojan DynaMag-96 a automatizované stanice KingFisher Duo Prime/Flex.
• Vakuový manifold a pumpa pro filtrační/SPE pláty.
• UHPLC-MS soustava (Vanquish UHPLC, Q Exactive BioPharma) pro analýzu peptidů a intact proteinů.

Hlavní výsledky a diskuse

Testy na standardních proteinech prokázaly dokončenou digesci již za 5 minut u menších proteinů (insulin, lysozym, karbonanhydráza). U složitých matic (plazma) se doba prodlužuje až na 75 minut. Díky vysoké teplotě a termostabilním enzymům není nutná redukce a alkylace před digescí pro mnoho kvantitativních aplikací. Výsledky ukazují srovnatelný profil PTM oproti konvenčním metodám.

Přínosy a praktické využití metody

SMART Digest Kit usnadňuje integraci do biofarmaceutických workflow díky:

• Minimalizaci manipulačních kroků a času přípravy vzorku.
• Zvýšené reprodukovatelnosti a konzistenci šarží.
• Možnosti škálování od jednotlivých vzorků po high-throughput platformy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření automatizace pomocí magnetických stanic a robotických manipulátorů, integrace s pokročilými UHPLC-MS systémy, vývoj nových termostabilních proteáz a aplikace pro detailní analýzu post-translačních modifikací a komplexních biologických vzorků.

Závěr

SMART Digest Kit poskytuje robustní, rychlou a snadno použitelnou platformu pro enzymatickou digesci proteinů, která zvyšuje efektivitu a kvalitu dat v biopharma výzkumu a rutině QC.

Reference

Thermo Fisher Scientific (2017) SMART Digest Kit User Manual, Version 2, XX21543 Revision B, December 2017.