High-precision, automated peptide mapping of proteins

Význam tématu

Mapování peptidů je klíčovou metodou pro charakterizaci bioterapeutik a ověření správného aminokyselinového pořadí a posttranslačních modifikací. Automatizace této procedury významně zvyšuje reprodukovatelnost, snižuje chybovost uživatele a zkracuje čas přípravy vzorků až 24krát ve srovnání s konvenčními postupy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout robustní, vysoce přesný a plně automatizovaný postup proteolytické digesce vhodný pro obecné peptide mappingové aplikace v chromatografii a hmotnostní spektrometrii. Studie demonstruje použitelnost metody na několika proteinech včetně cytochromu c, somatotropinu a monoklonálních protilátek.

Použitá metodika a instrumentace

Proteiny byly zpracovány buď manuálně, nebo pomocí magnetických kuliček SMART Digest a platformy KingFisher Duo Prime pro automatickou digesci při 70 °C. Peptidy se přímo injektovaly na Vanquish Horizon UHPLC s detekcí UV a v kombinaci s Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS pro potvrzení sekvence.

Použitá instrumentace

• KingFisher Duo Prime Purification System
• Thermo Scientific SMART Digest Trypsin Kit (magnetická pryskyřice)
• Vanquish Horizon UHPLC System s Hypersil GOLD kolonkou
• Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap hmotnostní spektrometr

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaný protokol umožnil kompletní digesci za méně než 1 hodinu s RSD plochy peptidů pod 3,1 % a 100% pokrytím sekvence. Rozdíl mezi manuálním a automatizovaným postupem se projevil v průměrně 1,5× nižší variabilitě u automatizace. Reprodukovatelnost potvrdily i digesce provedené pěti různými uživateli a u dvou monoklonálních protilátek.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace minimalizuje manuální zásahy a zajišťuje přesné načasování digesce, čímž se snižuje riziko dalšího vzniku modifikací. Workflow je vhodné jak pro hloubkovou charakterizaci bioterapeutik v HRAM MS, tak pro rutinní QC založenou na UV signálu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na širší škálu proteinů, integrace s pokročilou softwarovou analýzou a využití ve vysokopropustných a mikrofluidních platformách. Dále bude zajímavé sledovat aplikaci pro monitorování kritických kvalitativních atributů v reálném čase.

Závěr

Vyvinutý automatizovaný postup s kombinací SMART Digest magnetické pryskyřice a KingFisher Duo Prime představuje vysoce přesné, rychlé a reprodukovatelné řešení pro peptide mapping bioterapeutik, které významně zjednodušuje rutinní i pokročilou analýzu.

Reference

• Application Note 1134, LC-UV-MS Peptide Mapping Development for Easy Transfer to LC-UV QA/QC, Thermo Fisher Scientific (2015)
• SPALHMolBio1014, Reproducible liquid handling for the molecular biology workflow, Thermo Fisher Scientific (2014)
• Technical Guide 21544, SMART Digest and SMART Digest ImmunoAffinity Kit, Thermo Fisher Scientific (2016)
• Technical Note KFDuoPrime_0415, KingFisher Duo Prime System, Thermo Fisher Scientific (2015)
• Application Note 1124, Providing the Highest Retention Time and Peak Area Reproducibility, Thermo Fisher Scientific (2015)
• Application Note 1132, Reliable Results in Peptide Mapping Using the Vanquish Flex UHPLC System, Thermo Fisher Scientific (2015)