Oligonucleotide characterization for quality control and increased productivity by single quadrupole mass spectrometer with extended mass range

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá kontrola kvality syntetických oligonukleotidů je klíčová pro biotechnologický výzkum, farmaceutický vývoj i diagnostiku. Klasická kvalitativní analýza pomocí UV detekce poskytuje jen omezené informace o hmotnosti a přítomnosti nečistot. Integrace hmotnostní spektrometrie (MS) s vysokým hmotnostním rozsahem do běžných UV QC metod zvyšuje přesnost potvrzení identity, kvantifikaci a detekci stopových nečistot, aniž by se výrazně prodloužila doba analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ukázat, že připojení Thermo Scientific ISQ EM jednochromatického spektrometru s rozsahem m/z 10–2000 k existující UHPLC/UV QC metodě umožní rychlé potvrzení hmotnosti oligonukleotidů o délce 29–40 bp, odhad úrovně nečistot a kvantifikaci výtěžku v jednom běhu.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografie:

• Reverzní fáze s iontovým párováním (TEA/HFIP) na polymerní kolonce DNAPac RP 2.1×10 mm.
• Krátký gradient 15→60 % methanolu při 0,5 mL/min.
• UV detekce při 260 nm pro kvantifikaci.

MS:

• Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC s ISQ EM jednochromatickým spektrometrem (m/z 600–2000).
• HESI zdroj, negativní režim, zdrojové podmínky optimalizované pro 0,5 mL/min.
• Chromeleon™ 7.2.9 CDS pro řízení a zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• UV kalibrace 37mer oligonukleotidu v rozsahu 0,05–50 µM vykázala R2=0,9996.
• MS kalibrace založená na XIC a SIM skenech pro -9 nábojový stav dosáhla R2 až 0,966.
• Mass accuracy všech oligonukleotidů (29–40 mer) <±0,1 Da, RSD ≤0,02 %.
• Detekce nečistot: N-1, depurinace, 2-cyanoethyl, isobutyryl, chloral a iontové addukty (K+, Na+, HFIP); odhad hladin nečistot 0,1–39 %.
• Dobrá robustnost zdroje, nevyžadující čištění i po >100 injekcích.
• Dostatečné zlepšení opakovatelnosti plošného integrálu při prodloužení doby equilibrace mezi injekcemi z 1 na 4,5 min.

Přínosy a praktické využití metody

Nasazení ISQ EM MS do UV QC protokolu umožňuje:

• Okamžité potvrzení hmotnosti a identity oligonukleotidů.
• Časově nenáročné odhalení a hrubé kvantifikace nečistot, které se chromatograficky nerezolvují.
• Udržení stávajících eluentů a iontově párovacích podmínek.
• Zefektivnění laboratorních QC workflow bez potřeby vysokoúrovňové MS expertízy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření MS-based QC do automatizovaných linek pro syntézu oligonukleotidů, integrace s vysokorozlišovacími spektrometry pro detailnější identifikaci nečistot a aplikace ve vývoji nukleových acidových léčiv, vakcín a diagnostických metod.

Závěr

Studie demonstrovala, že přidání jednochromatického MS s rozšířeným hmotnostním rozsahem do rychlé UHPLC/UV QC metody významně zlepšuje potvrzení identity, odhalení nečistot a opakovatelnost analytických měření, aniž by byla ohrožena jednoduchost ovládání.

Reference

• Apffel A. et al. Analysis of oligonucleotides by HPLC-electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 1997, 69, 1320–1325.
• Nikcevic I. et al. Detecting low-level synthesis impurities in modified phosphorothioate oligonucleotides using LC-HRMS. Int. J. Mass Spectrom. 2011, 304, 98–104.