Visualization of Glutamate Decarboxylase Activity Localization in Germinated Legume Seeds with the iMScope™ QT

Význam tématu

Glutamát decarboxyláza (GAD) katalyzuje přeměnu L-glutamátu na GABA, klíčový metabolit rostlinné signalizace, regulace pH, C/N poměru a odpovědí na stres. GABA rovněž ovlivňuje nutriční vlastnosti potravin, zejména klíčených luštěnin, které jsou zdrojem této aminokyseliny. Dosud neexistovala metoda pro přímou lokalizaci GAD aktivity ve tkáních semen. Cílem studie je vyvinout histochemickou techniku využívající MS imaging pro prostorové zobrazení GAD aktivity v klíčených semenech sóji a vojtěšky.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo 1) optimalizovat podmínky enzymatické reakce GAD na mikrotéčcích tkání, 2) vizualizovat distribuci reakčního produktu (GABA-d3) ve vrstvách klíčených semen luštěnin pomocí iMScope QT a 3) ukázat univerzálnost metody na různých semenech (sója, vojtěška).

Použitá metodika a instrumentace

Pro tokovou detekci GAD aktivity byly použity kryořezané řezy semen aplikované na ITO sklíčka, na která se štětcem nanášel deuterovaný substrát Glu-d3 (50 mM). Sekce se inkubovaly při optimalizovaných podmínkách, následovalo nanesení CHCA matricí systémem iMLayer a MALDI-MS imaging.

• Enzymatická histochemie s podáním Glu-d3 substrátu
• Nanášení matricí: iMLayer matrix vapor deposition system (CHCA)
• MALDI-MS imaging: iMScope QT s vestavěným mikroskopem a LCMS-9030 Q-TOF
• Kryo zpracování: Cryo lm SECTION-LAB folie, CMC embedování, ITO sklíčka s vodivou páskou
• Nanášení substrátu: airbrush (GSI Creos)
• Analýza dat: IMAGEREVEAL MS imaging software, ROI analýza, ANOVA s Bonferroni korekcí

Hlavní výsledky a diskuse

• Potvrzení tvorby GABA-d3 ve spektru sójových řezů: detekce m/z 151,08 (Glu-d3) a m/z 107,09 (GABA-d3).
• Optimální podmínky: pH 5,8, teplota 60 °C, doba reakce 3 minuty.
• Prostorové zobrazení v sójových semenech ukázalo vysokou akumulaci GABA-d3 v hypocotylu, zejména v kořenovém vrcholu.
• Vysoké rozlišení (15 µm) odhalilo výraznější signál v cévním systému a meristému než v parenchymu.
• Metoda úspěšně fungovala i na malých semenech vojtěšky, prokazujíc podobný vzorec lokalizace aktivity.

Přínosy a praktické využití metody

• První přímá vizualizace GAD aktivity in situ ve tkáních rostlin.
• Možnost studovat roli GAD při klíčení a abiotic­kých/biotic­kých stresech, např. sodíkem.
• Aplikace v potravinářství pro vývoj potravin bohatých na GABA.
• Platforma pro současné zobrazování endogenních metabolitů, exogenních sloučenin a enzymových aktivit.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Study lokalizace GAD aktivity v různých plodinách (hnědá rýže, ječmen, banán).
• Analýza vlivu soli a dalších stresorů na expresi a aktivitu GAD během klíčení.
• Současné zobrazování enzymové aktivity s distribucí fytohormonů a růstových regulátorů.
• Vývoj nových agrochemikálií na základě znalostí o lokalizaci enzymových aktivit.

Závěr

Studie představuje první úspěšnou metodu vizualizace GAD aktivity v semenech pomocí MALDI-MS imaging. Optimalizované podmínky umožnily odhalit distribuci GABA-d3 především v hypocotylu a kořenovém vrcholu klíčených semen. Metoda je univerzální a nabízí širší uplatnění v analýze enzymových aktivit, stresových odpovědí a vývoji potravin či odolných plodin.

Reference

1. Ikuta S., Shinohara N., Fukusaki E., Shimma S. Mass spectrometry imaging enables visualization of the localization of glutamate decarboxylase activity in germinating legume seeds. J. Bioeng. Biosci. 134, 356–361 (2022).
2. Gomori G. Microtechnical demonstration of phosphatase in tissue sections. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 42, 23 (1939).
3. Walker R.P., Chen Z.H., Johnson K.E., et al. Using immunohistochemistry to study plant metabolism: localization of amino acids and PEP carboxykinase. J. Exp. Bot. 52, 565–576 (2001).
4. Jiang J. Fluorescence in situ hybridization in plants: recent developments and applications. Chromosome Res. 27, 153–165 (2019).
5. Läuchli A. Cryostat technique for fresh plant tissues and its application in enzyme histochemistry. Planta 70, 13–25 (1966).
6. Molero M.E., Alarcón M.V., Uriarte D., et al. Histochemical and immunohistochemical analysis of phenolic metabolism enzymes during berry development in Vitis vinifera. Protoplasma 256, 25–38 (2019).
7. Takeo E., Fukusaki E., Shimma S. Mass spectrometric enzyme histochemistry method for visualizing in situ cholinesterase activity in Mus musculus and Drosophila melanogaster. Anal. Chem. 92, 12379–12386 (2020).
8. Takeo E., Sugiura Y., Ohnishi Y., et al. Mass spectrometric enzyme histochemistry for choline acetyltransferase reveals de novo acetylcholine synthesis in rodent brain and spinal cord. ACS Chem. Neurosci. 12, 2079–2087 (2021).
9. Wisman A.P., Minami M., Tamada Y., et al. Visualization of dipeptidyl peptidase B enzymatic reaction in rice koji using mass spectrometry imaging. J. Biosci. Bioeng. 134, 133–137 (2022).
10. Li L., Dou N., Zhang H., Wu C. The versatile GABA in plants. Plant Signal. Behav. 16, e1862565 (2021).
11. Matsuyama A., Yoshimura K., Shimizu C., et al. Characterization of glutamate decarboxylase mediating GABA increase in early germination of soybean. J. Biosci. Bioeng. 107, 538–543 (2009).
12. Zhao G., Xie M., Wang Y., Li J. Molecular mechanisms underlying GABA accumulation in giant embryo rice seeds. J. Agric. Food Chem. 65, 4883–4889 (2017).
13. Al-Quraan N., Al-Ajlouni Z., Obedat D. The GABA shunt pathway in germinating seeds of wheat and barley under salt stress. Seed Sci. Res. 29, 250–260 (2019).
14. Johnson B.S., Singh N.K., Cherry J.H., Locy R.D. Purification and characterization of glutamate decarboxylase from cowpea. Phytochemistry 46, 39–44 (1997).
15. Sastyanarayan V., Nair P.M. Purification and characterization of glutamate decarboxylase from Solanum tuberosum. Eur. J. Biochem. 150, 53–60 (1985).
16. Pramai P., Thanasukarn P., Thongsook T., et al. Glutamate decarboxylase extracted from germinated rice: enzymatic properties and its application in soymilk. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 65, 166–170 (2019).
17. Guo Y., Yang R., Chen H., Song Y., Gu Z. Accumulation of GABA in germinated soybean in relation to GAD and diamine oxidase activity induced by additives under hypoxia. Eur. Food Res. Technol. 234, 679–687 (2012).
18. Runqiang Y., Yongqi Y., Qianghui G., Zhenxin G. Purification, properties and cDNA cloning of glutamate decarboxylase in germinated faba bean. Food Chem. 138, 1945–1951 (2013).
19. Matsumoto T., Yamaura I., Funatsu M. Improved purification and spectroscopic properties of squash glutamate decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 60, 889–890 (1996).
20. Yang R., Feng L., Wang S., Yu N., Gu Z. Accumulation of GABA in soybean by hypoxia germination and freeze-thawing incubation. J. Sci. Food Agric. 96, 2090–2096 (2016).
21. Luo X., Wang Y., Li Q., et al. Accumulating mechanism of GABA in soybean during germination. Int. J. Food Sci. 53, 106–111 (2018).
22. Lucas W.J., Groover A., Lichtenberger R., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. J. Integr. Plant Biol. 55, 294–388 (2013).
23. Oh S., Choi W. Changes in levels of GABA and glutamate decarboxylase in developing soybean seedlings. J. Plant Res. 114, 309–313 (2001).
24. Snedden W.A., Arazi T., Fromm H., Shelp B.J. Calcium/calmodulin activation of soybean glutamate decarboxylase. Plant Physiol. 108, 543–549 (1995).
25. Yin Y., Yang R., Guo Q., Gu Z. NaCl stress and supplemental CaCl₂ regulating GABA metabolism pathways in germinating soybean. Eur. Food Res. Technol. 238, 781–788 (2014).
26. Yin Y., Cheng C., Fang W. Effects of the inhibitor of glutamate decarboxylase on development and GABA accumulation in germinating fava beans under hypoxia-NaCl stress. RSC Adv. 8, 20456–20461 (2018).
27. Yang R., Wang S., Yin Y., Gu Z. Hypoxia treatment on germinating faba bean seeds enhances GABA-related protection against salt stress. Chil. J. Agric. Res. 75, 184–191 (2015).
28. Tester M., Davenport R. Na⁺ tolerance and Na⁺ transport in higher plants. Ann. Bot. 91, 503–527 (2003).
29. Parijadi R., Yamamoto K., Ikram M., et al. Metabolome analysis of banana treated with chitosan coating and low temperature reveals delayed ripening. Front. Sustain. Food Syst. 6 (2022).
30. Hu W., Liu J., Yang X., et al. Identification of a gene encoding glutamate decarboxylase involved in postharvest fruit ripening process in banana. HortScience 49, 1056–1060 (2014).