Sensitive and Accurate Quantitation of Phosphopeptides Using TMT Isobaric Labeling Technique

Význam tématu

Analýza fosfoproteomů je klíčová pro pochopení regulačních procesů v buňkách, neboť fosforylace ovlivňuje aktivitu a funkci mnoha proteinů. Přesná a citlivá kvantifikace fosfopeptidů pomáhá mapovat signální dráhy a detekovat jemné změny při stimulaci buňky, například inzulínem či IGF-1.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout nové metody Synchronous Precursor Selection (SPS) MS3 pro kvantifikaci TMT značených fosfopeptidů s vyšší mírou identifikací a lepší kvantitativní přesností oproti standardním HCD MS2 a klasickému SPS MS3. Nové metody byly ověřeny na modelových vzorcích a následně aplikovány na analýzu fosfoproteomu buněčné linie A549 po stimulaci inzulínem a IGF-1.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Thermo Scientific EASY-nLC 1000 UPLC, kolona EASY-Spray 50 cm
• Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Fusion a Orbitrap Fusion Lumos Tribrid
• Metody akvizice: HCD MS2, standardní SPS MS3, multistage activation (MSA) SPS MS3, neutral loss trigger MS3
• Software a analýza dat: Proteome Discoverer v.2.1 se SEQUEST HT, filtrace na 1% FDR, lokalizace fosforylace pomocí ptmRS

Hlavní výsledky a diskuse

• Standardní SPS MS3 ztratila ~34 % fosfopeptidových identifikací oproti HCD MS2. Nové metody zvýšily identifikace fosfopeptidů až o 16 % (MSA SPS) a 33 % (NL trigger) a lokalizaci fosforylace o 30 %–40 %.
• MSA SPS udržovala vysokou míru kvantifikace (96 %) a přesnost kvantifikace s nízkou odchylkou oproti HCD MS2.
• Neutral loss trigger MS3 umožnila kombinovat výhody fragmentace CID a HCD v jednom experimentu, což zlepšilo identifikaci i kvantifikaci.
• Aplikace na A549 buňky odhalila identifikaci 12 465 fosfopeptidů (10 436 kvantifikovatelných) se 94 % replikabilitou. Byly mapovány signální dráhy mTOR, AMPK a dráha regulace délky života, s odhalením rozdílů mezi inzulínovou a IGF-1 stimulací.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje hlubší a přesnější analýzu fosfoproteomů v biomedicínském a farmaceutickém výzkumu.
• Použití nových akvizičních strategií podporuje objev potenciálních biomarkerů a cílových míst v signálních drahách.
• Metody jsou kompatibilní s běžně dostupnou instrumentací Thermo Fisher Scientific.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace akvizičních parametrů pro různé typy PTM (post-translačních modifikací).
• Integrace s datově-řízenými přístupy a umělou inteligencí pro automatizovanou detekci a interpretaci signálních sítí.
• Rozšíření do klinických laboratoří pro profilování fosfoproteomu pacientských vzorků.

Závěr

Nové SPS MS3 metody Multistage Activation a Neutral Loss Trigger výrazně zlepšují citlivost, identifikaci a lokalizaci fosforylace v multiplexním TMT kvantitativním workflow. Aplikace na analýzu fosfoproteomu A549 po stimulaci inzulínem a IGF-1 prokázala vysokou robustnost, reprodukovatelnost a schopnost odhalit jemné biologické rozdíly.

Reference

1. Ting L., Rad R., Gygi S., Haas W. Nat Methods. 2011;8(11):937–940.
2. Palumbo A. et al. Mass Spectrom Rev. 2011;30(4):600–625.
3. Schroeder M. et al. Anal Chem. 2004;76:3590–3598.
4. Erickson B. et al. Anal Chem. 2015;87:1241–1249.