A Chromatographic Separation of Biological Macromolecules

Význam tématu

Chromatografická separace biologických makromolekul je klíčová pro charakterizaci a kontrolu kvality bioterapeutik, jako jsou monoklonální protilátky, peptidy či oligonukleotidy. Efektivní rozlišení intactních proteinů, jejich variant, agregátů a posttranslačních modifikací zajišťuje spolehlivé výsledky ve výzkumu, vývoji i rutinním QA/QC v biotechnologickém průmyslu.

Cíle a přehled studie

Tento dokument shrnuje hlavní chromatografické techniky používané k analýze biomolekul a představuje nabídku Agilent kolon a metodik pro:

• reversed-phase (RP) separaci intactních proteinů a peptidů,
• size exclusion chromatography (SEC) pro agregáty a fragmenty,
• ion exchange chromatography (IEX) pro nábojem podmíněné varianty,
• hydrophobic interaction chromatography (HIC) pro jemné rozlišení modifikací,
• hydrophilic interaction chromatography (HILIC) pro vysoce polární analyty,
• affinity chromatography pro selektivní izolaci IgG.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika je založena na moderních UHPLC/HPLC systémech s detekcí DAD/UV, případně MS či vícedetekčními postupy (např. multiúhlová laserová rozptylová detekce ve spojení s UV nebo RI). Navrženy jsou kolony:

• polymerní a křemičité částice s různou chemickou vazbou (C3–C18, diphenyl),
• superficiálně porézní vs. úplně porézní struktura,
• velikosti částic od 1,8 µm do 5 µm a více,
• pórové velikosti od 300 Å do 1000 Å a vyšší pro velké komplexní struktury (viry, LNP),
• monolitické a bio-monolitické formáty pro vysokoprůtokové módy.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve studii se ukázalo, že:

• pro intactní proteiny nad 70 kDa je vhodnější kratší alkylový řetězec (C4, C3 nebo diphenyl),
• pórové velikosti ≥3× hydrodynamického poloměru molekuly (300–500 Å) poskytují optimální rozlišení mAb,
• zvýšení teploty (60–80 °C) i volba vhodného organického modifikátoru (ACN, propanol) zlepšují tvar špiček a obnovu,
• SEC kolony s 200–500 Å póry spolehlivě oddělují agregáty, monomery i fragmenty,
• IEX s pH o 0,5–1 jednotku od pI analyzované bílkoviny umožňuje detailní rozlišení nábojových variant,
• HIC v prostředí 1–2 M (NH₄)₂SO₄ rozlišuje jemné rozdíly v hydrofobicitě mAb a ADC,
• HILIC kolony pro glykanovou mapu zkracují čas analýzy až trojnásobně při zachování selektivity,
• affinity kolony Protein A/G dosahují vysoké selektivity pro izolaci IgG z komplexních matric.

Přínosy a praktické využití metody

Výsledné metodiky nacházejí uplatnění v:

• posouzení integrity a čistoty bioterapeutik,
• monitoringu stability a agregace během vývoje léčiv,
• glykoanalýze pro licenční dokumentaci,
• kontrole modifikačních variant a DAR (drug-to-antibody ratio) v ADC,
• analýze metabolitů v buněčných kulturách pro procesní kontrolu,
• ošetření vzorků před LC/MS analýzou.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• dvojrozměrnou LC (2D-LC) kombinující ortogonální módy,
• miniaturizaci a vyšší automatizaci pro vysokopropustné screeningy,
• integraci multi-detektorů pro hlubší charakterizaci makromolekul,
• vývoj zcela bioinertních materiálů pro citlivé komplexní vzorky,
• pokročilé softwarové nástroje pro prediktivní návrh separací.

Závěr

Komplexní nabídka chromatografických módu a kolon umožňuje cílenou separaci širokého spektra biologických makromolekul. Správná volba chemie, pórové velikosti, částic i provozních parametrů poskytuje robustní, reprodukovatelné a vysoce výkonné metody vhodné pro akademický výzkum i biopharma průmysl.