Gradient elution of ionic compounds

Význam tématu

Ionová chromatografie je nadále klíčovou technikou pro separaci a kvantifikaci anorganických a organických iontů v prostředích od pitné vody až po komplexní biologické vzorky. Gradientní eluce zásadně rozšiřuje možnosti klasického izokratického režimu tím, že zvyšuje počet rozlišených špiček (peak capacity) a současně komprimuje pozdní eluce, čímž zkracuje dobu analýzy a zlepšuje rozlišení složitých směsí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem článku je představit principy a různé podoby gradientních elucí v iontové chromatografii – včetně koncentrace, složení, kapacity a pH gradientů – a demonstrovat jejich využití pro separaci anorganických aniontů, kationtů, biopolymerů (aminokyseliny, sacharidy, oligonukleotidy) i terapeutických protilátek.

Použitá metodika a instrumentace

Soustava pro gradientní iontovou chromatografii obvykle sestávala z isokratické pumpy doplněné o nízkotlaký gradientní modul, elektrolitického generátoru eluenta (EG) pro KOH a MSA, vysokokapacitní membránový potlačovač (suppressor), termostatovaného separačního sloupce a detektorů:

• Sprušena vodivost (suppressed conductivity)
• Integrovaná pulzně amperometrická detekce (IPAD)
• UV/VIS detekce
• Nebulizační detektory: ELS, CAD
• Hmotnostní spektrometrie (MS)

Demonstrované kolony: Dionex IonPac AS11, AS19, CS18, CS19, AminoPac PA10, CarboPac PA200, DNAPac PA200, GlycanPac AXR-1, Acclaim Mixed-Mode WAX-1/WCX-1, Acclaim Trinity P1/P2, MAbPac SCX-10.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie ukazuje široké spektrum aplikací:

• Koncentrační gradienty KOH (0,5–60 mmol/L) pro separaci standardních aniontů, organických kyselin v nápojích i složitých směsí s nízkou detekční mezí (< µg/L).
• Přídavek organického modifieru (MeOH) pro zlepšení rozlišení monokarboxylových kyselin v analýze ovocných šťáv a piva.
• Gradienty NaOH/NaOAc pro neobarvené aminokyseliny, fosforylované aminokyseliny a oligosacharidy detekované pulzně-amperometricky.
• Solné gradienty (NaCl, NaClO4) v Tris pH 8 pro rozlišení oligonukleotidů ssDNA.
• Koncentrační gradienty MSA pro simultánní separaci anorganických kationtů a organických aminů.
• pH gradienty (MES–CAPSO) pro analýzu nábojových variant monoklonálních protilátek se stabilními a lineárními profily pH.
• Mixed-mode kolony pro současnou analýzu aniontů a kationtů, neutralních a polárních sloučenin; trimodální kolony Acclaim Trinity rozšiřují aplikace na farmaceutické protijony a API v jedné analýze.

Přínosy a praktické využití metody

Gradientní eluce v kombinaci s moderní instrumentací a potlačovači umožňuje vysoce citlivé (< ng/L) a rychlé (< 10 min) separace komplexních vzorků s širokým rozsahem retencí. Elektrolitický generátor eluenta zaručuje bezkarbonátové, reprodukovatelné podmínky. Mixed-mode sloupce dovoľují simultánní analýzu aniontů, kationtů i nepolárních látek bez potřeby derivačních kroků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj směřuje k:

• Trimodálním a UHPLC podporujícím sloupcům s menšími částicemi pro rychlejší, vysokorozlišení analýzy.
• Integrovaným high-throughput platformám s automatizací vzorkování.
• Rozvoji nových pH gradientních buffrů pro co nejlineárnější profil.
• Hybridním integracím s HR-MS pro nativní charakterizaci glykokonjugátů a proteinových variant.

Závěr

Gradientní iontová chromatografie se díky moderním generátorům eluenta, vysokokapacitním suppressorům a specializovaným sloupcům stala univerzálním nástrojem pro analýzu široké škály anorganických, organických i biomolekulárních iontů s vysokou citlivostí, rozlišením a flexibilitou.

Reference

• Small H., Stevens T.S., Bauman W.C.: Novel ion exchange chromatographic method using conductimetric detection. Anal. Chem. 1975, 47, 1801–1809.
• Rocklin R.D., Pohl C.A., Schibler J.A.: Gradient elution in ion chromatography. J. Chromatogr. 1987, 411, 107–119.
• Liu Y. et al.: On-line large capacity high purity acid and base generation devices in ion chromatography. Pittcon 1998.
• Farnan D., Moreno G.T.: Multiproduct high-resolution monoclonal antibody charge variant separations by pH gradient IEC. Anal. Chem. 2009, 81, 8846–8857.
• Vlasak J., Ionescu R.: Heterogeneity of monoclonal antibodies revealed by charge-sensitive methods. Curr. Pharm. Biotechn. 2008, 9, 468–481.
• Weiss J.: Handbook of Ion Chromatography, 4th ed., Wiley-VCH 2016.