Improved Middle-Down Characterization of Antibodies Using Multiple Ion Activation Techniques and Ion-Ion Proton Transfer Reactions on a Modified Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Metoda middle-down sekvenování monoklonálních protilátek je klíčová pro detailní mapování aminokyselinové sekvence, lokalizaci posttranslačních modifikací a validaci struktury v biotechnologickém výzkumu i průmyslové kontrole kvality. Analýza středně velkých fragmentů (~25 kDa) kombinuje výhody top-down a bottom-up přístupů, přičemž umožňuje detekci dlouhých sekvenčních iontů a minimalizuje počet analytických běhů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem předložené studie bylo ověřit potenciál ion-ion proton transfer reakcí (IIPT) následovaných různými režimy aktivace (ETD, CID, HCD) pro zvýšení pokrytí sekvence a pozorování dlouhých produktových iontů u podjednotek NIST standardní monoklonální protilátky. Studie zahrnovala pět experimentálních sad s ETD+IIPT a další s CID+IIPT a HCD+IIPT na modifikovaném Orbitrap Fusion Lumos MS přístroji.

Použitá metodika a instrumentace

Dělení a příprava vzorku:

• Digesto IdeS a denaturační redukce (Guanidine/DTT) pro získání podjednotek Fc/2, LC, Fd (~25 kDa).
• Reverzní chromatografie (RP-LC, 25 cm × 100 µm, 0,1 % FA ve vodě vs. ACN) s přetížením kolony pro zvýšení signálu.

Instrumentace:

• Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS s modifikovaným tranzportem ETD a druhým vstřikem pro IIPT činidlo (perfluoroperhydrophenanthrene).
• Duální buňka lineárního iontového pastiště s prodlouženou vysokotlakou sekcí.
• Akvizice MS2/MS3 profilových spekter, dekonvoluce v BioPharma Finder 3.0 a analýza v ProSight Lite.

Hlavní výsledky a diskuse

Experimenty 1–5 (MS/ETD/MS/IIPT) poskytly nejvíce dlouhých sekvenčních iontů pro všechny podjednotky. Agregovaná sekvenční pokrytí dosažená v ETD+IIPT experimentech se pohybovala významně nad výsledky bez IIPT. Naproti tomu CID+IIPT (exp. 6–7) dosáhlo pokrytí 19 % (Fd), 31 % (LC, Fc/2) a HCD+IIPT (exp. 8–9) pouhých 13–17 %.
Význam dlouhých iontů spočívá v jednoznačném mapování kontinuálních úseků sekvence a lepším rozlišení variant izoform a modifikací.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace IIPT po ETD výrazně zlepšuje schopnost detekce velkých fragmentů, což ulehčuje validaci a kvantifikaci struktury protilátek v biotechnologických aplikacích. Tento přístup lze využít v QA/QC rutinních analýzách a při vývoji biosimilárních látek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření IIPT na UVPD produktové ionty pro další zvýšení pokrytí sekvence. Optimalizace okének m/z pro CID a HCD by mohla zlepšit výsledky i v těchto režimech. Dále je perspektivní integrace middle-down přístupů do automatizovaných pracovních postupů pro charakterizaci komplexních biopolymerů.

Závěr

Preliminární studie potvrdila, že přidání IIPT reakcí k ETD významně zvyšuje pozorování dlouhých sekvenčních iontů u mAb podjednotek ve srovnání s čistým ETD, CID nebo HCD. Tento přístup přináší nové možnosti pro detailní charakterizaci protilátek v biotechnologickém a farmaceutickém výzkumu.

Reference

1. Houel S. et al. Middle-down analyses of monoclonal antibody on Orbitrap Fusion Lumos Tribrid. HUPO 2017.
2. Anderson L. C. et al. Protein derivatization and sequential ion/ion reactions to enhance ETD. IJMS 2015.
3. Mullen C. et al. Improved top-down sequence coverage by IIPT subsequent to ETD and UVPD. ASMS 2018.
4. Sanders J., Holden D. et al. Reducing congestion in UVPD spectra using proton transfer. ASMS 2018.