A Robust Workflow for Biosimilar Comparability Assessment via Intact and Subunit RPLC-MS and Native IEX-MS with the Xevo G3 QTof MS Platform

Význam tématu

Analýza biosimilárních monoklonálních protilátek vyžaduje vysokou přesnost při identifikaci různých variant glykosylace a nábojových forem. Tyto charakteristiky ovlivňují bezpečnost, účinnost a stabilitu léčiv, a proto jsou klíčové pro schválení nových biosimilárních přípravků regulačními úřady.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout robustní workflow pro komparativní hodnocení innovátoru (Remicade) a tří biosimilárních infliximabů (Inflectra, Avsola, Renflexis) za použití:

• intaktní reverzní chromatografie spojené s QTof MS (RPLC-MS),
• subjednotkové RPLC-MS po enzymatickém štěpení IdeS,
• rodinné iontové výměnné chromatografie v nativním módu spojené s MS (IEX-MS).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky každé z látek byly analyzovány ve trojím opakování:

• Intaktní denaturované protilátky RPLC-MS na sloupci ACQUITY Premier BEH C4 řízeném UNIFI softwarem.
• Subjednotkové analýzy po štěpení IdeS (Fd + LC a Fc fragmenty) na stejném systému.
• Rodinná IEX-MS analýza v nativním módu na BioResolve SCX mAb kolóně s inline UV detekcí.
• Všechny metody byly provozovány na platformě Xevo G3 QTof řízené informatikou waters_connect.

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní RPLC-MS s MaxEnt1 dekonvolucí umožnilo detekci N-glykokonfigurací do hladiny <5 % relativního zastoupení. Byly identifikovány rozdíly v poměru glykokanálů FA2/FA2G1, FA2G1/FA2G2 a dalších.
Subjednotková analýza po IdeS štěpení dosáhla kvantifikace Fc-glykosylací až na 1 % úrovni. Detekovány byly i minoritní imunogenní struktury NeuGc a α-Gal.
Native IEX-MS potvrdila existenci tří hlavních nábojových variant odpovídajících rozdílům v C-terminálních lyzinových zbytcích. K potvrzení byla použita inkubace s karboxypeptidázou B.
Komparativní analýza biosimilárů ukázala konzistentně snížený podíl C-terminálních lysinových variant a odlišné rozložení glykokonfigurací ve srovnání s Remicade.

Přínosy a praktické využití metody

• Workflow umožňuje komplexní profilování mAb atributů s vysokou citlivostí a přesností.
• Platforma Xevo G3 QTof zajišťuje simultánní měření UV a MS signálu pro rychlé QA/QC kontroly.
• Přístup lze implementovat v regulačních laboratořích pro potvrzení biosimilarity i stability výroby.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření nativních metod pro analýzu vyšších řádů agregátů a komplexů. Dále lze integrovat umělou inteligenci pro automatizované rozpoznání variant a predikci kvality. Kombinace s jinými technikami (CE-MS, HDX-MS) nabídne ještě hlubší vhled do struktury a dynamiky mAb.

Závěr

Popsané workflow kombinuje intaktní a subjednotkovou RPLC-MS s nativním IEX-MS na platformě Xevo G3 QTof. Metoda prokázala schopnost rozlišit jemné rozdíly v glykosylaci a nábojových variantách infliximabu a jeho biosimilárů, což podporuje její využití pro komplexní komparativní analýzy v biotechnologickém i regulačním prostředí.