High-Speed Simultaneous Analysis of Amino Acids by Pre-column Derivatization Using Automatic Pretreatment Function

Význam tématu

Analýza aminokyselin hraje klíčovou roli ve farmaceutickém, potravinářském i biochemickém výzkumu. Rychlé a spolehlivé stanovení jednotlivých aminokyselin je nezbytné pro kontrolu kvality, studium metabolismu a vývoj nových produktů. Předsloupcová derivatizace s následnou vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC) umožňuje významné zkrácení doby analýzy a zjednodušení pracovních postupů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo optimalizovat podmínky pro simultánní analýzu 20 proteogenních aminokyselin pomocí předsloupcové derivatizace v automatizované předúpravě vzorku na přístroji Nexera XR. Hlavními úkoly bylo dosáhnout vysoké rychlosti měření (do 26 minut), vynikající linearity kalibračních křivek a nízké opakovatelnosti signálu.

Použitá instrumentace

• HPLC systém Shimadzu Nexera XR
• Fluorescenční detektor RF-20AXS (kanály: Ex/Em 350/450 nm a 266/305 nm)
• Column: Shim-pack XR-ODSII, 100 mm × 3,0 mm, 2,2 µm
• Autosampler s funkcí automatické předúpravy vzorku

Použitá metodika

Analýza byla založena na automatizované předsloupcové derivatizaci ve vzorkové jehle. Derivatační činidla O-ftalaldehyd (OPA) a 9-fluorenylmethyl chloroformát (FMOC) reagují s aminokyselinami za pokojové teploty během míchání vzorku s činidly v několika krocích. Následně se provádí gradientní eluce s mobilními fázemi A (acetátový pufr pH 6), B (acetonitril/voda 9:1) a C (acetátový pufr pH 5 s EDTA) při průtoku 1,0 mL/min a teplotě kolony 40 °C. Celková doba běhu činí 26 minut.

Hlavní výsledky a diskuse

• Simultánní rozdělení a detekce 20 proteogenních aminokyselin během 26 min: baseline separace klíčových párů.
• Linearity kalibračních křivek r² ≥ 0,999 pro koncentrace 1 – 100 µmol/L.
• Opakovatelnost relativní odchylky plochy (< 1,5 % RSD, výjimkou pro prolin ~4,9 %).
• Analýza vzorku piva demonstrovala aplikovatelnost metody pro reálné matrice, s dobře rozlišenými pík

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy ve srovnání s postkolonovou derivatizací.
• Minimalizace spotřeby vzorku a činidel díky automatizované přípravě.
• Snížení variability díky konstantnímu časovému režimu derivatizace.
• Vysoká univerzálnost přístroje pro analýzu dalších skupin organických látek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Systémy s automatizovanou předsloupcovou derivatizací budou i nadále přispívat k vyššímu provoznímu výkonu laboratoří. Očekává se rozšíření použití pro aminokyseliny v klinické diagnostice, bioprodukci a proteomice. Integrace s online vzorkovacími jednotkami a další miniaturizační kroky zvyšují potenciál pro vysokoprůtokový screening a multi-analytické platformy.

Závěr

Použití automatizované předsloupcové derivatizace na HPLC Nexera XR umožňuje rychlou, přesnou a opakovatelnou simultánní analýzu 20 aminokyselin s vynikající lineární odezvou a nízkou spotřebou reagentů. Metoda je vhodná pro rutinní i výzkumné aplikace v různých odvětvích analytické chemie.

Reference

• Shimadzu Corporation: High-Speed Simultaneous Analysis of Amino Acids by Pre-column Derivatization Using Automatic Pretreatment Function; Application News 01-00441-EN, First Edition: Sep. 2022.