A Novel LC MS/MS Method for the Direct Analysis of Underivatized Amino Acids In Human Plasma

Význam tématu

Analýza aminokyselin v lidské plazmě je klíčovým nástrojem pro diagnostiku vrozených metabolických poruch, sledování nutričního stavu pacientů a hodnocení účinnosti léčebných postupů. Přímé stanovení bez derivatizace zkracuje dobu analýzy a zjednodušuje workflow v klinických i výzkumných laboratořích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je vyvinout rychlou, citlivou a přesnou metodu LC-MS/MS pro nepřímou analytiku 45 aminokyselin v lidské plazmě bez nutnosti pre- nebo post-kolonní derivatizace. Metoda má umožnit vysokopropustné stanovení s celkovým časem cyklu 13 minut.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek plazmy byl deproteinizován kyselinou sulfosalicylovou, po centrifugaci byla odebrána čirá supernatantní fáze, do níž byly přidány vnitřní standardy a PBS pro vyrovnání salinity. Analytická chromatografie proběhla na HILIC/iontově výměnném sloupci Raptor Polar X (100×2,1 mm, 2,7 µm) s mobilní fází A (0,5 % kyselina mravčí, 1 mM formiát amonný ve vodě) a B (0,5 % kyselina mravčí, 1 mM formiát amonný v 90:10 acetonitril:voda), gradient 13 minut, tok 0,3 mL/min, injekční objem 5 µL, teplota sloupce 35 °C. Detekce na Waters Xevo TQ-S v režimu pozitivní ESI se scheduled MRM.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografické rozlišení 45 aminokyselin včetně izobarických párů (leucin/izoleucin/allo-izoleucin, alanin/sarkosin) s opakovatelnou retencí po vyrovnání salinity.
• Všech 45 sloučenin vykázalo lineární kalibrační křivky v rozsahu 1–500 µmol/L (r2 > 0,990, kvadratická regrese 1/x), přičemž pro vysoce koncentrované aminokyseliny (glutamin, alanin) byla nutná diluce vzorku.
• Přesnost a preciznost metody (n=9) splnily kritéria s relativními odchylkami (RSD) pod 20 % a hodnotami v rámci nom. rozsahů pro tři úrovně kontrolních plazemických vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda značně zjednodušuje přípravu vzorku a zkracuje dobu analýzy, což umožňuje vysokopropustné vyšetření aminokyselinového profilu. Je vhodná pro rutinní monitoring pacientů s metabolickými poruchami, nutriční hodnocení i farmakokinetické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace přípravy vzorků a integrace s robotickými systémy.
• Rozšíření panelu o modifikované aminokyseliny a peptidické deriváty.
• Vyšší rozlišení a citlivost v kombinaci s vysokorozlišovacími hmotnostními spektrometry pro odhalení nových biomarkerů.
• Validace metody pro klinické diagnostické účely a standardizace mezi laboratořemi.

Závěr

Prezentovaná LC-MS/MS metoda umožňuje přímou analýzu 45 aminokyselin v lidské plazmě s jednoduchou přípravou vzorku, vysokou propustností a spolehlivými analytickými parametry. Díky rychlému 13minutovému běhu a robustní separaci představuje efektivní nástroj pro klinický výzkum i rutinní analýzy.

Reference

1. Liang S-H, Steimling J. A Novel LC-MS/MS Method for the Direct Analysis of Underivatized Amino Acids in Human Plasma. Restek Corporation.