A Validated Method for the Quantification of Amino Acids in Mammalian Urine

Význam tématu

Aminokyseliny představují klíčové molekuly v savčí biochemii jako stavební kameny proteinů, neurotransmitery nebo nosiče lipidů. Rychlá a přesná kvantifikace těchto sloučenin v biologických vzorcích je zásadní pro pochopení fyziologických procesů a patofyziologie onemocnění. Tradiční chromatografické metody často vyžadují složitou přípravu a dlouhou dobu analýzy, což omezuje jejich využití při vysoké zátěži vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat jednoduchou a robustní metodu UPLC-MS/MS pro absolutní kvantifikaci 20 proteinogenních aminokyselin v moči potkanů v rozsahu 0,2–200 µM a relativní stanovení dalších 18 aminokyselin. Metoda byla optimalizována pro vysokou analytickou průchodnost (nastavení až 192 vzorků/den) a spolehlivost měření v náročných biologických matricích.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky moči se upravily precipitací proteinů pomocí methanolu s 0,1 % kyseliny mravenčí a přidáním stabilně značených vnitřních standardů. Derivatizace proběhla AccQ•Tag Ultra činidlem při 55 °C po dobu 10 minut v borátovém pufru (pH 8,6). Chromatografická separace využila ACQUITY UPLC HSS T3 kolonu (1,8 µm, 2,1 × 150 mm) při 45 °C s lineárním gradientem vody a acetonitrilu s 0,1 % kyseliny mravenčí během 7,5 minuty. Detekce probíhala na Xevo TQ-S micro v režimu pozitivní elektrospray ionizace a MRM akvizice.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class
• Kolona ACQUITY UPLC HSS T3 1,8 µm, 2,1 × 150 mm
• Xevo TQ-S micro
• AccQ•Tag Ultra derivatizační činidlo
• MassLynx a TargetLynx Software
• StepWave ion guide

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vynikající separaci aminokyselin s šířkou vrcholu ~3 s a bez driftu retenčního času. Citlivost umožnila stanovení LLOQ na 0,2 µM. Validace podle FDA jediného dne prokázala dobrou přesnost (bias < 5 %) a opakovatelnost (CV většinou < 10 %) napříč rozsahy QC. Kalibrační křivky měly korelační koeficienty r2 ≥ 0,9998, což potvrzuje linearitu nad tři dekády koncentrací.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká průchodnost: analýza 192 vzorků za 24 h.
• Široký rozsah detekce 0,2–200 µM pokrývá fyziologické i patologické koncentrace.
• Minimalizace časově náročných derivatizačních kroků a nutnosti úplné chromatografické separace od forem obsahujících aminy.
• Robustní instrumentace odolná vůči složitým matricím biologických vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k rozšíření počtu stanovovaných aminokyselin, automatizaci přípravy vzorků a integraci do komplexnějších metabolomických platforem. Metoda má potenciál pro adaptaci na klinickou diagnostiku a vývoj miniaturizovaných systémů pro bodové testování.

Závěr

Vyvinutá UPLC-MS/MS metoda nabízí rychlou, citlivou a spolehlivou kvantifikaci aminokyselin v močových vzorcích s vysokou analytickou průchodností. Díky robustnímu provedení a vynikajícím validačním parametrům představuje efektivní alternativu k tradičním chromatografickým technikám pro výzkumné aplikace.