A Novel LC-MS/MS Quantification Method for Amino Acids in Human Plasma, Including Alloisoleucine, without Ion Pairing or Derivatization

Význam tématu

Analýza aminokyselin v lidské plazmě je klíčová pro diagnostiku dědičných metabolických poruch, zejména onemocnění jako MSUD. Vzhledem k vysoké polaritě těchto sloučenin je nutná účinná chromatografická separace bez kompromisů na citlivosti a robustnosti. Metody bez derivatizace nebo iontového párování přinášejí zkrácení doby analýzy, zjednodušení přípravy vzorku a významné snížení provozních nákladů.

Cíle a přehled studie / článku

Předložená metoda představuje nový LC-MS/MS postup pro simultánní kvantifikaci 47 aminokyselin v jediné analytické injekci, včetně separace a specifické detekce alloisoleucinu – klíčového markeru pro novorozenecký screening MSUD. Hlavním cílem bylo vyvinout rychlý, citlivý a nákladově efektivní protokol bez nutnosti derivatizace či iontového párování.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace

• LC-MS/MS: Shimadzu LCMS-8050 (triple quadrupole)
• UHPLC systém: Shimadzu Nexera X2
• Kolona: Intrada Amino Acid 150 mm (Imtakt Company)

Mobilní fáze A obsahovala acetonitril, tetrahydrofuran a 0,3 % kyselinu mravenčí v ammonium formátu, mobilní fáze B pak acetonitril s ammonium formátem v gradientním módu. Objem injekce byl pouhý 1 µl. Příprava vzorku spočívala ve precipitaci bílkovin, centrifugaci a přímé injekci supernatantu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla chromatografické separace a kvantifikace 47 aminokyselin v čase 25 min. Díky optimalizovaným MRM přechodům a chromatografickému rozlišení byla spolehlivě rozlišena izobarická skupina leucinu, isoleucinu a alloisoleucinu. Kalibrátory i kontrolní plazmové vzorky vykázaly přesnosti v rozmezí 80–120 % a RSD < 15 % (intra- i interdenní). Specifické přechody posilují selektivitu, zejména při detekci alloisoleucinu jako markeru MSUD.

Přínosy a praktické využití metody

Nový postup eliminuje potřebu derivatizace a iontového párování, zjednodušuje přípravu vzorku a snižuje náklady z přibližně 13 EUR na méně než 2 EUR na vzorek. Velmi krátká doba analýzy a robustnost metody ji předurčují pro rutinní klinickou diagnostiku, novorozenecký screening a kontrolu kvality v laboratorním prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze dále rozšířit o další aminokyseliny na základě požadavků. Potenciál vidíme v integraci do multiplexových metabolomických panelů, sledování farmakokinetiky léčiv, nutričních studiích i vysokoprůtokových screeningových programech pro velké populace.

Závěr

Představený LC-MS/MS postup nabízí rychlou, citlivou a nákladově úspornou kvantifikaci širokého spektra aminokyselin v lidské plazmě bez derivatizace či iontového párování. Metoda prokázala spolehlivost a reprodukovatelnost a je vhodná pro diagnostiku MSUD i další klinické a výzkumné aplikace.

Reference

1. A Jaffuel, M Levi, A novel fast quantification method for amino acids in human plasma by LC-MS/MS, without ion pairing or derivatization, poster presented at the 3rd MSACL EU Conference on Mass Spectrometry, Salzburg, Austria, 2015